Metabolômica untargeted em urina de portadores de Cri Du Chat utilizando cromatografia a gás e espectrometria de massas (GC-MS)
No primeiro e segundo capítulos desta tese, duas abordagens metabolômicas untargeted fingerprinting e perfil metabólico de ácidos orgânicos utilizando urina de portadores e não-portadores da síndrome Cri Du Chat (CDC) foram a...
| Autor: | |
|---|---|
| Formato: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2020 |
| País: | Brasil |
| Recursos: | Universidade de São Paulo (USP) |
| Repositorio: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
| Idioma: | portugués |
| OAI Identifier: | oai:teses.usp.br:tde-23102020-102820 |
| Acesso em linha: | https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75135/tde-23102020-102820/ |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palavra-chave: | fingerprinting metabólico ácidos orgânicos Cri Du Chat syndrome dried urine on paper metabolic fingerprinting metabolômica untargeted organic acids síndrome do Cri Du Chat untargeted metabolomics urina seca em papel |
| Resumo: | No primeiro e segundo capítulos desta tese, duas abordagens metabolômicas untargeted fingerprinting e perfil metabólico de ácidos orgânicos utilizando urina de portadores e não-portadores da síndrome Cri Du Chat (CDC) foram aplicadas para avaliar possíveis alterações nas vias bioquímicas devido à condição genética. Inicialmente, o melhor solvente para precipitação de proteínas/extração de metabólitos foi avaliado, seguido por planejamento fatorial 23 para otimização das condições de derivação das amostras. Adicionalmente, três diferentes sistemas de extração líquido-líquido de ácidos orgânicos foram avaliados. Os metabólitos derivatizados foram analisados por cromatografia a gás e espectrometria de massas (GC-MS) nas condições: temperatura do injetor, da interface do MS e da fonte de íons em 250, 290 e 250 ºC, respectivamente; modo scan (45-600 m/z). Métodos univariados e multivariados de análise como análise de componentes principais (PCA), análise discriminante pelo método de mínimos quadrados parciais (PLS-DA), teste-t foram aplicados para discriminação dos grupos controle, e os metabólitos com valores de importância variável na projeção (VIP) maiores que 1,0 e p < 0,05 foram selecionados como os responsáveis pela separação entre os grupos. Deste modo, metanol e um método adaptado de extração líquido-líquido foram selecionados como o melhor solvente e melhor método de extração de ácidos orgânicos, respectivamente, por obterem maiores números de metabólitos identificados com altas intensidades e com boa reprodutibilidade entre as medidas. Temperatura e tempo de derivação (60 ºC e 120 min, respectivamente), e 400 µL de urina foram as melhores condições selecionadas devido ao número de múltiplas respostas obtidas. Porém, volumes de urina e reagentes de derivação foram reduzidas à metade (urina: 200 µL; cloridrato de metoxiamina em piridina (MeOx) e N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida (MSTFA): ambos 25 µL) devido à redução de custos, mas sem interferir na qualidade dos dados cromatográficos. Utilizando as duas abordagens metabolômicas, diferentes vias bioquímicas foram alteradas devido à condição genética: para o fingerprinting metabólico, o metabolismo da glicólise/gliconeogênese, da fenilalanina, da tirosina e da sacarose e amido foram as vias mais impactadas devido a síndrome CDC; e para o perfil metabólico, o metabolismo do triptofano, da tirosina/fenilalanina, e de polifenóis produzidos pela ação da microflora intestinal. Esses resultados correlacionam as alterações bioquímicas e moleculares com as características fenotípicas associadas à síndrome CDC. No terceiro capítulo, amostras de urina foram depositadas e secas em papel filtro Whatman® 903 (1,4 cm × 2,5 cm) para avaliação da conservação do perfil metabólico urinário conforme o tempo de armazenamento (1, 5, 10 e 30 dias) e sob o efeito da temperatura (−20 °C e 25 °C). Após os tempos previamente estabelecidos, a urina foi dessorvida do papel utilizando água deionizada e os metabólitos recuperados foram derivados com MeOx e MSTFA e analisados por GC-MS. O método de análise univariada teste-t foi utilizado para avaliação estatística dos dados. Desse modo, os perfis cromatográficos das amostras de urina depositadas em papel foram similares sob as diferentes condições de armazenamento, bem como perfis semelhantes entre amostras depositadas e seca em papel com a amostra de urina analisada diretamente e foram observadas, mostrando que os perfis metabólicos são conservados ao longo do tempo, sob diferentes temperaturas, e utilizando a técnica de deposição e secagem da urina em papel filtro. Não houve diferença estatística significativa (p > 0,005) entre as intensidades dos metabólitos identificados em relação ao tempo e temperatura de armazenamento, o que mostra a não necessidade de baixas temperaturas para garantir a estabilidade química dos metabólitos ao longo do tempo de armazenamento quando a urina é depositada em papel filtro. Portanto, a partir desse comportamento tem-se que o papel filtro pode ser utilizado para a coleta e o armazenamento de urina em modo simples para posterior determinação de biomarcadores para diversas doenças. |
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