Caracterización, localización y función del módulo CDC-42-RAC-CDC-24 y de las proteínas BUD-2 y BUD-5 en el hongo filamentoso Neurospora crassa
Neurospora crassa es un hongo filamentoso que se caracteriza por la formación de hifasaltamente polarizadas. La morfogénesis de las hifas requiere del establecimiento y delmantenimiento de la polaridad celular, ambos procesos son regulados por múltiplescomplejos proteicos. Las proteínas Rho GTPasas...
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| Tipo de documento: | tese |
| Estado: | Versão publicada |
| Data de publicação: | 2012 |
| País: | México |
| Recursos: | Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada |
| Repositório: | Repositorio Institucional CICESE |
| Idioma: | espanhol |
| OAI Identifier: | oai:cicese.repositorioinstitucional.mx:1007/602 |
| Acesso em linha: | http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/602 |
| Access Level: | Acceso aberto |
| Palavra-chave: | info:eu-repo/classification/Autor/Hongo filamentoso,Neurospora crassa,CDC-42,RAC,CDC-24,BUD-2,BUD-5,Ciencias del mar info:eu-repo/classification/cti/2 info:eu-repo/classification/cti/24 info:eu-repo/classification/cti/2414 |
| Resumo: | Neurospora crassa es un hongo filamentoso que se caracteriza por la formación de hifasaltamente polarizadas. La morfogénesis de las hifas requiere del establecimiento y delmantenimiento de la polaridad celular, ambos procesos son regulados por múltiplescomplejos proteicos. Las proteínas Rho GTPasas son consideradas importantes en laregulación de la polaridad celular en eucariotas, por lo que en este trabajo se analizó elmódulo constituido por las Rho GTPasas CDC-42, RAC y su activador, el factor deintercambio de guanina (GEF) CDC-24 en el hongo N. crassa. Cdc-42p se ha denominadocomo el regulador maestro de la polaridad en levaduras, sin embargo en este trabajo secomprobó que para N. crassa este gen no es esencial. Se determinó que las mutantes Δcdc-42 y Δrac son viables, aunque con fenotipos que presentan colonias muy compactas e hifascon morfología irregular, mientras que las dobles mutantes con pérdida de alelos de cdc-42y rac son letales, sugiriendo que ambas proteínas comparten al menos una función esencial.Por otro lado, se observó que la mutante de Δcdc-24 es letal, lo cual sugiere que el GEFCDC-24 es fundamental para la activación de CDC-42 y RAC. Mediante el análisis in vivopor microscopía confocal se determinó que el módulo CDC-42 – RAC – CDC-24 estáasociado a la membrana celular y organizado en forma de capucha apical cuando esetiquetado con proteínas fluorescentes en el extremo N-terminal. Las tres proteínas selocalizaron en el domo apical de las hifas con una distribución distinta y aparentementecomplementaria. CDC-42 está confinada en forma de media luna a la membrana del ápicecelular, RAC también está asociada a membrana pero en forma de anillo, excluyendo laregión ocupada por CDC-42. CDC-24 ocupó una posición estratégica asociándose amembrana plasmática en forma creciente en el ápice celular, así como en el citosol apicalexcluyendo la zona del Spitzenkörper (Spk). Por otra parte, CDC-42 y RAC presentaronuna localización temporal distinta durante el proceso de formación de ramificaciones ydurante la germinación de esporas. Ambas proteínas se acumularon en la membrana iiplasmática antes de la formación de una rama. Sin embargo CDC-42 apareció primero queRAC, aproximadamente un minuto antes de la emergencia de la rama, mientras que RACapareció después, alrededor de 20 segundos antes de la emergencia de la rama. Durante lagerminación, GFP-CDC-42 se acumula en una región específica en la membrana celular deesporas durante la fase de hidratación y en los ápices de los tubos germinativos, mientrasque RAC aparece una vez que se ha formado el tubo germinativo. Esto sugiere que ambasGTPasas juegan un papel importante en la regulación de la polaridad celular. CDC-42aparentemente participa en la iniciación de la polarización celular mientras que la funciónprincipal de RAC pudiera ser el mantenimiento de un crecimiento polarizado. Lageranilgeranilación de CDC-42 es importante para su anclaje a membrana, ya que aletiquetar CDC-42 con la proteína fluorescente mCherry en el C-terminal, lageranilgeranilación se ve interrumpida y el patrón de localización difiere con respecto aletiquetamiento en el extremo N-terminal. Tanto en hifas maduras como en germínulas lalocalización de CDC-42-mCherryFP se observó en el ápice celular ocupando la partecentral del Spk, sugiriendo que la localización en membrana plasmática depende de lageranilgeranilación. Sin embargo al parecer ésta no es importante para llevar a cabo sufunción ya que la polaridad celular es restablecida en la cepa homocarión obtenidamediante la cruza genética de la mutante Δcdc-42 con la cepa cdc-42::mchfp. Además lalocalización de CDC-42-mCherryFP durante la formación de septos y ramificacioneslaterales no se ve afectada.Otros componentes involucrados en el establecimiento de la polaridad celular y enmantener un crecimiento polarizado en levaduras son las proteínas BUD-2 y BUD-5 que enN. crassa muestran distintos patrones de localización tanto en hifas maduras como engermínulas. En hifas maduras BUD-2 es confinada al ápice celular ocupando la partecentral del Spk, mientras que BUD-5 se observó tanto de forma citosólica, con un puntobrillante en la parte central dando la apariencia de abanico, como asociada a la membranaapical, por lo que ambas proteínas colocalizan parcialmente. Durante la germinación deesporas y en la elongación de las germínulas, BUD-2 se observó en la membranaplasmática apical, mientras que BUD-5 se encontró tanto de forma citosólica en el ápicecomo asociada a la membrana apical. Así mismo ambas proteínas mostraron unalocalización distinta durante diversos eventos morfogenéticos donde BUD-2 participó en laformación de septos y BUD-5 en marcar los sitios de ramificaciones laterales. Esto sugiereque aparte del papel que ambas proteínas aparentemente juegan en el establecimiento de lapolaridad, también participan en diferentes procesos asociados a la morfogénesis celular deN. crassa. |
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