Fermentación de subproductos protein-quitinosos (desechos de camarón) por Bacillus thuringiensis, para la producción de proteasa extracelular y cristales insecticidas

La presente tesis forma parte de una línea de investigación tendiente a aprovechar los desechos de camarón por vía microbiana, utilizando a Bacillus thringiensis para la producción de proteasas, quitinasas, cristales insecticidas y un remanente sólido útil para la obtención de quitina y quitosana. S...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: LUZ IRENE ROJAS AVELIZAPA
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:1999
País:México
Institución:Universidad Autónoma Metropolitana
Repositorio:Repositorio Institucional de la UAM Iztapalapa
Idioma:español
OAI Identifier:oai:bindani.izt.uam.mx:bn9997519
Acceso en línea:https://doi.org/10.24275/uami.bn9997519
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:info:eu-repo/classification/LEM/Fermentación
info:eu-repo/classification/LEM/Quitina
info:eu-repo/classification/LEM/Fermentation
info:eu-repo/classification/LEM/Chitin
info:eu-repo/classification/cti/3
Descripción
Sumario:La presente tesis forma parte de una línea de investigación tendiente a aprovechar los desechos de camarón por vía microbiana, utilizando a Bacillus thringiensis para la producción de proteasas, quitinasas, cristales insecticidas y un remanente sólido útil para la obtención de quitina y quitosana. Sin embargo, por la amplitud y complejidad que presenta una investigación de tal envergadura, el presente estudio aborda sólo los tres aspectos siguientes: i). La selección y caracterización de una cepa de Bacillus thringiensis, capaz de crecer en un medio conteniendo como Único ingrediente desechos secos y molidos de camarón, suspendidos en agua de suministro, para producir proteasas, quitinasas y cristales bioinsecticidas. ii). El estudio de materia prima y de algunas variables fisico-químicas que influyen en la producción de la proteasa a escala de matraz y fermentador, y iii). La caracterización parcial de la proteasa a nivel de extracto crudo. La selección en su fase primaria se llevó a cabo con 152 cepas de B. thuringzensis, sembrándolas en placas con medios ólidos específicos, para evaluar la producción de caseinasas y quitinasas extracelulares, por el tamano y el aspecto de los halos de hidrólisis en torno alas colonias de cada cepa. También se evaluó la producción de queratinasa extracelular (otro tipo de proteasa), sembrando las bacterias en un medio con lana tenida con azul brillante de remazol, cuya hidrólisis es evaluada por el incremento en la absorbancia a 585 nm. De este estudio resultaron ocho cepas cristalíferas, con un adecuado balance en la producción de caseinasas, queratinasas y quitinasas. La selección secundaria consistió en cultivar las ocho cepas promisorias, en un medio líquido conteniendo carapacho molido de camarón al 2% en agua de suministro, para hacer estudios cinéticos de la producción de proteasas. Cabe mencionar que en las fases primaria y secundaria de la selección se utilizaron también cepas patrón como Bt-149 especialmente proteolítica; Serratia marcescens W, muy proteo-quitinolítica, así como Bt-HD-1 y Bt-HD-73 usadas como referencia debido a su alta capacidad bioinsecticida. Al final quedaron sólo las cepas Bt-103 y Bt-112 para abordar una selección terciaria, en base a la capacidad insecticida de sus cristales purificados; aunque se hicieron estudios complementarios sobre la caracterización de ambas cepas. Los resultados obtenidos después de realizar bioensayos contra insectos modelo, abarcando dípteros, coleópteros y lepidópteros, mostraron que Bt-112 era moderadamente tóxica hacia el lepidóptero Manduca sexta, el gusano del tabaco, y por lo mismo se adoptó como cepa de trabajo para continuar la investigación. Cabe destacar que' Bt-112 posee cristales bipiramidales asociados a inclusiones cuboidales y esféricas, con proteínas cry de 65-70 y 130 kDa, semejantes a las encontradas en la cepa patrón internacional HD-1, aunque su perfil plasmídico (5.8, 7, 8.7 y 34 h4Da) es muy diferente. Además, la serotipificación mostró que Bt-112 pertenece a la variedad tohuorthi, en tanto que HD-1 corresponde a la variedad kurstak. Por su parte la cepa Bt-103 pertenece al serovar. finitimus, sus cristales pleomorficos están fbertemente asociados a la espora, y posee plásmidos de 47 y 80 MDa. En suma, aún cuando sólo Bt-112 he insecticida, ambas cepas resultaron muy interesantes, sobre todo en cuanto a su perfil plasmídico, el cual no ha sido reportado en ninguna otra cepa. Por otro lado, la morfología de los cristales de la cepa Bt-103 también resultó ser novedosa. Tanto Bt-112 como Bt- 103, heron tipificadas y conservadas en la colección del Instituto Pasteur, Francia, que es el centro de acopio y referencia de cepas de B. thuringzemis más importante a nivel internacional. En cuanto a los estudios para mejorar la producción de la proteasa extracelular de Bt112, en cultivo sumergido a escala de matraz, éstos se iniciaron relacionando análisis bromatológicos de la materia prima, con su capacidad para propiciar la síntesis de la enzima. De este modo se encontró que el contenido proteico actúa favorablemente, no así el contenido de grasas, de sal y de amonio. go se demostró haciendo estudios cinéticos, que la producción de proteasa alcanza un máximo (374 UP/ml) a 3 1"C, empleando el sustrato al 2%, suspendido en agua de suministro, con una agitación de 180 rpm y sin ningún ajuste en el pH inicial del medio (alrededor de 8.8), al cabo de 32 h de incubación. Al intentar aumentar los rendimientos llevando el proceso a escala de fermentador de laboratorio (New-Brunswick Bioflo m, 4 l), se encontró que utilizando las condiciones óptimas de los experimentos en matraz, aún con un mejor control y aireación (0.5 wm y 375 rpm), no se mejoró la producción de la enzima (350 UP/ml), aún cuando se redujo el tiempo de máxima producción de 32 a 22 h de incubación Tampoco se logró elevar la concentración enzimática en el caldo, al mantener constante el pH del medio a 7, o al aumentar la agitación y la aireación. Bajo estas condiciones se propició la solubilización de las proteínas presentes en el sustrato y con ello la formación de espuma. Esto obligó a la adición de antiespumante, el cual pareció tener un efecto dual, tanto sobre el microorganismo como sobre la proteasa ya presente en el medio, afectando drásticamente el rendimiento de la proteasa. Cabe destacar que los cristales insecticidas de Bt-112 se produjeron satisfactoriamente en el medio con carapacho de camarón a partir de las 24 h de incubación, tanto a nivel de matraz como de fermentador. Así mismo se produjeron modestas cantidades de quitinasa. Esto se debe a que en general, todas las cepas de B. thuringiensis estudiadas son poco quitinolíticas. En cuanto a la caracterización parcial de la proteasa extracelular de Bt-112, en forma de extracto crudo, puede destacarse que es una tiol-proteasa, sensible a los agentes quelantes, la cual mostró su máxima actividad a pH 8 y 45°C. Su vida media de anaquel en refrigeración (5OC) es de 1.9 meses, y de 2.7 meses en congelación (-1 5OC). El CaClz favoreció la acción de la proteasa, y según la concentración de la sal puede darse un efecto de activación, o de mayor estabilización al efecto de la temperatura. Los detergentes neutros favorecen la acción enzimática, lo contrario ocurre con la urea y los detergentes aniónicos. Finalmente, los experimentos de electroforesis ugieren la presencia de una sola proteasa de un peso molecular aproximado de 36 kDa. En suma, pueden considerarse como contribuciones del presente trabajo: La propuesta de uso novedoso para los desechos de camarón, como sustrato de fermentación para la producción de proteasa ycristales bioinsecticidas. Ampliar los usos biotecnológicos para B. thuringzensis; ya que hasta ahora su empleo se ha restringido a la producción de cristales. Las exoenzimas de B. thringiemis en lo general han sido poco estudiadas. En este trabajo se describen algunas características de la proteasa alcalina de esta bacteria.

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