Caracterización molecular de proteasas termoestables producidas por Aspergillus fumigatus
Actualmente el interés en la producción de enzimas termoestables se ha incrementado debido a la diversidad de aplicaciones y beneficios industriales que representan. El objetivo de la presente investigación fue la caracterización de los factores bioquímicos responsables de la termoestabilidad de pro...
| Autor: | |
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| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2011 |
| País: | México |
| Institución: | Universidad Autónoma Metropolitana |
| Repositorio: | Repositorio Institucional de la UAM Iztapalapa |
| Idioma: | español |
| OAI Identifier: | oai:bindani.izt.uam.mx:v118rd76r |
| Acceso en línea: | https://doi.org/10.24275/uami.v118rd76r |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | info:eu-repo/classification/LEM/Enzimas proteolíticas info:eu-repo/classification/LEM/Aspergillus fumigatus info:eu-repo/classification/LEM/Proteolytic enzymes info:eu-repo/classification/cti/6 |
| Sumario: | Actualmente el interés en la producción de enzimas termoestables se ha incrementado debido a la diversidad de aplicaciones y beneficios industriales que representan. El objetivo de la presente investigación fue la caracterización de los factores bioquímicos responsables de la termoestabilidad de proteasas fúngicas producidas por Cultivo en Medio Sólido (CMS). El trabajo se inicio seleccionando los hongos y levaduras capaces de crecer a 45°C, en esta etapa se seleccionaron 29 de 72 cepas. En una segunda etapa, se seleccionaron las cepas (2.2 aB, 2.7 aB y 36 aIV) productoras de proteasas en agar leche descremada. Posteriormente se evaluó la producción de proteasas en CMS con las cepas seleccionadas, las cepas 2.2 aB y 36 aIV alcanzaron la máxima actividad a las 36 h de cultivo, mientras que la cepa 2.7 aB requirió 48 h para alcanzar la máxima producción, misma que fue 45% menor que las cepas antes mencionadas, motivo por cual fue descartada. Los extractos enzimáticos producidos por las cepas 2.2aB y 36 aIV presentaron pH y temperatura óptimos de actividad de 9 y 7 respectivamente, a 50°C. El extracto producido por la cepa 2.2 aB presentó un tiempo de vida media (t1/2) de 2.96, 1.07, 0.74, 0.5, 0.33 y 0.16 h a 30, 40, 50, 60, 70 y 80°C, respectivamente. En contraste, los valores de t1/2 presentados por el extracto producido por la cepa 36 aIV fueron de 1.78, 1.0, 0.8, 0.33, 0.28 y 0.20 h a las mismas condiciones de temperatura. Debido a que la cepa 36 aIV mostró mayor estabilidad, ésta se seleccionó para continuar la presente investigación. Sin embargo, ambas cepas se identificaron molecularmente como: Yarrowia lipolytica (99%) y Aspergillus fumigatus (90%) para las cepas 2.2 aB y 36 aIV, respectivamente. Se purificaron dos proteasas producidas por Aspergillus fumigatus, las cuales fueron denominadas como A y B. Las proteasas A y B fueron purificadas a homogeneidad obteniéndose un porcentaje de recuperación de 6.6 y 3.9% con factor de purificación de 8.8 y 7.1, respectivamente. El peso molecular (SDS-PAGE, tinción plata) de las enzimas monoméricas puras fue de 88 y 45 kDa para la proteasa A y B, respectivamente. La proteasa B presenta N-glicosilación y el 29% del peso molecular es representado por los carbohidratos; en contraste proteasa A no presentó N-glicosilación. La caracterización de las enzimas puras indica que la proteasa A es activa en un rango de pH de 6 a 9, en un rango de temperatura de 50 a 64ºC mostrando la máxima actividad a pH 7 y 60ºC. En tanto que, la proteasa B exhibió actividad en un rango de pH de 8 a 12, en un rango de temperatura de 50 a 66ºC presentando la máxima actividad a pH 10 y 63ºC. Los estudios de estabilidad térmica indican que la proteasa A conserva el 58 y 43% de actividad residual a 50 y 60ºC, mientras que la proteasa B mantiene el 49 y 17% a las mismas condiciones de temperatura en una hora de ensayo. Los t1/2 indican que a 60 y 70ºC la proteasa A presenta mayor estabilidad que la proteasa B. En contraste a 50ºC la proteasa B presenta t1/2 12% mayores, sugiriendo que la proteasas A posee mayor termoestabilidad que la B a temperaturas mayores a 50ºC. La evaluación de la termoestabilidad de la proteasa B previamente digerida con endo H (deglicosilada) se observó que los valores de t1/2 disminuyen a 50 y 60ºC, mientras que a 70 y 80ºC se inactiva completamente. Dichos resultados sugieren que la glicosilación es una característica que confiere estabilidad térmica a esta proteasa. La cinética de inactivación térmica (ecuación Lumry-Eyrin) muestra valores absolutos de 67 kJ mol-1 y -69 J mol-1 de entalpía (∆H*) y entropía (∆S*) respectivamente para la proteasa A, mientras que para la proteasa B se obtuvieron valores de 130 kJ mol-1 y 124 J mol-1 de ∆H* y ∆S* respectivamente. Estos resultados confirman una mayor estabilidad térmica de la proteasa A con respecto a la B. Por otro lado, los parámetros calculados para las temperatura ensayadas indican que la ∆H* es independiente de la temperatura, indicando que no hay cambios en la capacidad calorífica en ambas enzimas. Asimismo, los valores de ∆S* para ambas enzimas fueron negativos, indicando estabilidad térmica en un rango de temperatura de 50 a 70 °C. Adicionalmente, los estudios de inhibición enzimática sugieren que las proteasas A y B pueden pertenecer a la familia de las serín proteasas. Finalmente se concluye que A. fumigatus produce al menos dos proteasas termoestables en CMS con diferentes características estructurales. La glicosilación es una característica estructural que podría participar en la estabilidad térmica de la proteasa B, no se observó efecto del estado de oligomerización en la termoestabilidad. La inserción de carbohidratos en la cadena proteica de la proteasa A, además de la adición de enlaces covalentes que permitan la rigidez y flexibilidad necesaria para la catálisis, permitiría obtener una enzima con características de estabilidad térmica mejoradas. Es importante mencionar que la proteasa A presentó mayor termoestabilidad que las producidas por otras cepas fúngicas previamente reportadas en la literatura. |
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