Identificación y caracterización de las cargas intracelulares asociadas a la miosina de clase V en el hongo filamentoso Neurospora crassa
El crecimiento apical polarizado es una característica fundamental de los hongos filamentosos, donde el movimiento de vesículas secretoras se realiza con ayuda de proteínas motoras a través del citoesqueleto de actina y microtubular. Específicamente, las miosinas de clase V son motores moleculares a...
| Author: | |
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| Format: | doctoral thesis |
| Status: | Published version |
| Publication Date: | 2019 |
| Country: | México |
| Institution: | Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada |
| Repository: | Repositorio Institucional CICESE |
| Language: | Spanish |
| OAI Identifier: | oai:cicese.repositorioinstitucional.mx:1007/2810 |
| Online Access: | http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/2810 |
| Access Level: | Open access |
| Keyword: | info:eu-repo/classification/Autor/Adaptadores, miosina, cargas, actina info:eu-repo/classification/Autor/Adapters, myosin, cargoes, actin info:eu-repo/classification/cti/2 info:eu-repo/classification/cti/24 info:eu-repo/classification/cti/2414 info:eu-repo/classification/cti/241406 |
| Summary: | El crecimiento apical polarizado es una característica fundamental de los hongos filamentosos, donde el movimiento de vesículas secretoras se realiza con ayuda de proteínas motoras a través del citoesqueleto de actina y microtubular. Específicamente, las miosinas de clase V son motores moleculares asociados a actina encargadas del transporte de cargas intracelulares en diferentes organismos. La asociación con la carga es mediada por la unión a adaptadores específicos. En Neurospora crassa existe solo una miosina de clase V (MYO-5) pero aún no queda claro las cargas que transporta, su dinámica y posible función en la morfogénesis de las hifas. Para identificar los adaptadores asociados con MYO-5, se hizo un ensayo de CoIP con anticuerpos anti-GFP utilizando la cepa MYO-5-GFP. Las proteínas aisladas fueron identificadas por espectrometría de masas y los adaptadores fueron seleccionados por análisis bioinformático, modelaje estructural y acoplamiento molecular. Las proteínas SNA-10 y RBA-1 fueron seleccionadas y se analizaron in silico para corroborar su asociación con MYO-5. Encontramos que la unión con estos adaptadores producía una gran estabilidad estructural en el dominio globular de la cola (GTD) de MYO-5, sugiriendo que SNA-10 y RBA-1 podrían estar asociados a MYO-5. El marcaje de los adaptadores con GFP para corroborar su asociación in vivo, afectó el desarrollo normal de las hifas. Para determinar la importancia del GTD de MYO-5 en la morfología de las hifas, generamos una versión truncada del GTD completo y una versión donde eliminamos el subdominio II en el GTD, y se analizó la localización de MYO-5. A diferencia de lo reportado, la morfología fue normal y la localización distinta en las hifas. Esto podría deberse a que el casete con el que se transformó pudo integrarse en otro sitio. Para conocer el comportamiento dinámico de MYO-5 con mayor detalle, analizamos las partículas individuales por TIRFM. Las partículas de MYO-5-GFP eran de distintos tamaños y la mayor parte del tiempo no se movían. Cuando se movían mantenían una velocidad de 1.08 µm s-1, aunque podían alcanzar velocidades de hasta 2.7 µm s-1 y el movimiento podía ser anterógrado o retrogrado. La velocidad de desplazamiento de MYO-5 sugiere que se trata de un motor no procesivo, que podría requerir de más de MYO-5 para transportar las cargas. Debido al efecto, previamente reportado, que la ausencia del gen completo myo-5 producía en la morfología de las hifas, observamos ... |
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