Synonymous changes in the human immunodeficiency virus genome as a strategy to study virus biology
La recodificación sinónima de los genomas se ha usado ampliamente para estudiar diferentes aspectos de la biología de los virus. Esta herramienta se basa en modificar la secuencia de nucleótidos de un gen sin cambiar la secuencia de aminoácidos, es decir, la secuencia de la proteína no se ve afectad...
| Autor: | |
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| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2019 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglés |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:240785 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/240785 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Virologia Virus de la immunodeficiència humana Canvis sinònims Virología Virology Virus de la inmnodeficiencia humana Human immunodeficiency virus Cambios sinónimos Synonymous chages Ciències Experimentals |
| Sumario: | La recodificación sinónima de los genomas se ha usado ampliamente para estudiar diferentes aspectos de la biología de los virus. Esta herramienta se basa en modificar la secuencia de nucleótidos de un gen sin cambiar la secuencia de aminoácidos, es decir, la secuencia de la proteína no se ve afectada. Estudios previos han demostrado atenuación viral debida a una reducción en la expresión proteica después de llevar a cabo la recodificación sinónima. De la misma manera, esta herramienta ha permitido la identificación de estructuras secundarias del ARN, la descripción de factores virales o interacciones con el sistema inmune innato, así como desentrañar la regulación temporal de los genes virales. En este trabajo hemos recodificado sinónimamente los genes de la proteasa y de la envuelta (Env) del Virus de Inmunodeficiencia Humana 1 (HIV-1). Comparamos el desarrollo de resistencias del HIV-1 a inhibidores de la proteasa (IPs) entre el virus salvaje (WT) y un virus sintético (MAX) que lleva una secuencia de la proteasa recodificada en el uso de pares de codones incluyendo 38 mutaciones sinónimas (13%). Los virus WT y MAX no muestran diferencias replicativas. Ambos virus fueron propagados en células MT-4 con la presión selectiva a dos IPs atazanavir (ATV) y darunavir (DRV). Tanto el virus WT como el MAX desarrollaron resistencias fenotípicas a IPs. Análisis clonales de secuenciación masiva revelaron que ambos virus desarrollaron mutaciones de resistencia a ATV y DRV previamente descritas. Sin embargo, las resistencias que desarrollaron las proteasas WT y MAX eran diferentes entre ambas variantes. Nuestros resultados indican que la proteasa recodificada del HIV-1 mostró una robustez y evolvabilidad similar al WT, pero la posición en el espacio de secuencias delinea la evolución de cada espectro mutante. Para estudiar cómo las mutaciones sinónimas afectan a la replicación viral, se diseñaron mutantes de Env que cambiaban el uso de codones y el uso de pares de codones; el número de dinucleótidos CpG también se alteró. La variante sintética del virus Recoded-env resultó letal para la viabilidad del VIH-1 después de cambiar su uso de codones mediante la modificación de 39 nucleótidos (1,5%). Análisis de expresión proteica revelaron que la traducción se había modificado en Recoded-env. Varios mutantes se diseñaron basados en Recoded-env para investigar la letalidad de este mutante. Uno de ellos, Recoded_env_3'Bwt, sólo revirtió a WT dos mutaciones de un mismo codón, el codón 34, localizado en la región codificante gp41. Es de resaltar que esta variante del virus no mostró diferencias en replicación en células MT-4 o PBMCs ni una reducción dramática en expresión proteica en comparación con el WT. El análisis de secuencias de gp41, donde se encuentra localizado el codón 34, demostró que la estructura secundaria del ARN estaba severamente interrumpida en Recoded-env. De la misma forma, después de cambiar el uso de pares de codones de env, se generaron 18 diferentes variantes que optimizaban, deoptimizaban o mantenían neutro el sesgo de pares de codones (CPB). Estas variantes confirmaron la importancia de las sustituciones sinónimas en la región codificante de gp41. Solo una de estas variantes, MinCpG.2, era viable con la región gp41 mutada. Se encontraron diferencias en esta región entre MinCpG.2 y el resto de variantes CPB que explicaban la letalidad. También observamos que dos variantes virales que tenían un CPB optimizado, Max-3'wt y MaxCpG-3'wt, mostraban una capacidad replicativa significativamente reducida cuando se comparó con el WT. Además, las variantes de CPB con diferentes proporciones de CpGs nos permitieron concluir que, en nuestro modelo, un número elevado de CpGs no atenuaba el virus. Nuestros resultados confirman que la recodificación sinónima de un gen o genoma es una herramienta muy útil para descifrar diferentes aspectos de la biología viral. |
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