Preclinical assessment of a gene editing approach for MNGIE
La MNGIE és una malaltia metabòlica rara causada per mutacions recessives en el gen TYMP, el qual codifica per l'enzim TP. Això causa una acumulació sistèmica de nucleòsids que provoca toxicitat mitocondrial, i normalment acaba sent letal durant les primeres dècades de vida. L'objectiu d&#...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2020 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/671287 |
| Acceso en línea: | http://hdl.handle.net/10803/671287 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Teràpia gènica Terapia génica Gene therapy Edició gènica Edición génica Gene edition MNGIE Ciències Experimentals 575 |
| Sumario: | La MNGIE és una malaltia metabòlica rara causada per mutacions recessives en el gen TYMP, el qual codifica per l'enzim TP. Això causa una acumulació sistèmica de nucleòsids que provoca toxicitat mitocondrial, i normalment acaba sent letal durant les primeres dècades de vida. L'objectiu d'aquest treball era aconseguir una integració eficaç de l'ADNc humà de TYMP dins d'un intró dels gens Tymp i Alb en hepatòcits per l'acció coordinada de dos elements: la CRISPR/Cas9 i els templates amb l'ADNc de TYMP. Aquests templates van ser dissenyats per a ser integrats en una regió subseqüent a un promotor genòmic, de manera que l'expressió de l'ADNc de TYMP estaria sota el seu control. En el cas del locus Alb, l'edició gènica correcta produiria una proteïna híbrida Alb-hTP que tindria capacitat secretora. Amb aquesta aproximació, els hepatòcits serien editats permanentment i l'ADNc de TYMP seria expressat a llarg termini, de manera que es resoldria el problema de pèrdua d'expressió del transgèn sovint detectada en teràpies gèniques convencionals. Es van provar dues estratègies diferents. En la primera, els ARNs de la CRISPR/Cas9 varen ser introduïts per nanopartícules (NPs). Això va permetre una expressió elevada però transitòria. Es van provar dues NPs diferents: les NPs polimèriques (PNPs) de GEMAT-IQS, i les NPs lipídiques (NPLs) d'Acuitas Therapeutics®. En la segona estratègia, el sistema CRISPR/Cas9 va ser lliurat com a ADN dins de vectors AAV. Els resultats in vitro i in vivo van corroborar que l'ADNc de TYMP podia ser inserit amb èxit en els dos loci. També vam corroborar la presència d'ARNm de TYMP i de proteïna TP funcional dins les cèl·lules editades. L'experimentació in vivo es va fer amb el model de ratolí de MNGIE. Els nivells plasmàtics de Thd i dUrd dels animals tractats van ser monitorats per valorar l'eficiència de les diferents estratègies d'edició gènica. Els millors resultats es van obtenir en els animals tractats amb les NPLs que portaven els ARNs de la CRISPR/Cas9 i els vectors rAAV2/8 que portaven els templates d'ADN. Aquests ratolins van presentar una correcció bioquímica estable i consistent que es va correlacionar amb la presència d'ARNm TYMP i d'enzim TP funcional en les cèl·lules del fetge. A més, els ratolins editats en el locus Alb van presentar una activitat TP significativa en plasma, el qual confirma que l'enzim híbrid pot ser secretat amb èxit tot mantenint la seva activitat en plasma. Tanmateix, la reducció de nivells plasmàtics de nucleòsids no va ser suficient per assolir els nivells detectats en els ratolins WT, de manera que hi ha espai per a l'optimització. Sorprenentment, en alguns casos l'edició gènica es va produir en absència de la CRISPR/Cas9, el qual suggereix que els templates d'ADN sols podrien provocar la inserció correcta a través de recombinació homòloga. Tots aquests resultats confirmen que la nostra estratègia d'edició gènica és viable, tot i que necessitem augmentar l'eficiència global del procediment per aconseguir una correcció bioquímica total en el model de MNGIE. |
|---|