Exploring the hidden layer of gene regulation
En les plantes, els petits ARN (sRNA) exerceixen un paper fonamental en la regulació de l'expressió gènica i en el manteniment de la integritat del genoma. No obstant això, les vies de processament i els orígens cel·lulars de molts sRNA endògens continuen sent poc caracteritzats. Aquesta tesi i...
| Autor: | |
|---|---|
| Formato: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2025 |
| País: | España |
| Recursos: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglés |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:322041 |
| Acesso em linha: | https://ddd.uab.cat/record/322041 |
| Access Level: | acceso embargado |
| Palavra-chave: | Biogènesi de sRNA SRNA biogenesis Biogénesis de sRNA Ciències Experimentals |
| Resumo: | En les plantes, els petits ARN (sRNA) exerceixen un paper fonamental en la regulació de l'expressió gènica i en el manteniment de la integritat del genoma. No obstant això, les vies de processament i els orígens cel·lulars de molts sRNA endògens continuen sent poc caracteritzats. Aquesta tesi investiga la biogènesi, el processament i la localització compartimental dels transcrits productors de sRNA en Arabidopsis thaliana, amb un enfoc especial en DICER-LIKE 3 (DCL3), l'enzim nuclear principalment responsable de generar sRNA de 24 nucleòtids implicats en la silenciació gènica transcripcional (TGS). Per identificar directament els substrats endògens de DCL3, vaig establir un protocol rigorós de coimmunoprecipitació combinat amb seqüenciació profunda dels sRNA units a una forma catalíticament inactiva de DCL3 (DCL3ci). Aquest enfoc va permetre analitzar i caracteritzar, per primera vegada de manera directa, els substrats de DCL3. Tal com s'esperava, la majoria dels transcrits associats a DCL3 provenen d'elements transposables (TEs) i depenen en gran mesura de l'ARN POLIMERASA IV (Pol IV) i de l'ARN-DEPENDENT ARN POLIMERASA 2 (RDR2). Es van observar patrons d'interacció diferenciats entre les superfamílies de TE, la qual cosa reflecteix diferències en l'origen o l'estructura dels precursors. A més, vam caracteritzar un conjunt divers de substrats no canònics, incloent-hi precursors estructurats com ara loci transcrits per l'ARN polimerasa II, ARN no codificants independents de RDR2 i miARN joves. Aquests precursors generen sRNA funcionals de 24-nt capaços de carregar-se en proteïnes ARGONAUTE (AGO), suggerint la seva participació en la silenciació gènica a través de mecanismes no canònics dependents de DCL3. De manera destacada, MIR168a va emergir com el locus amb més interacció amb DCL3ci. Donat que miR168a regula AGO1, l'efector central de la silenciació gènica post-transcripcional (PTGS), aquesta associació inesperada suggereix una possible interacció entre TGS i PTGS. En paral·lel, vaig establir un enfoc transcriptòmic mitjançant la classificació de nuclis activada per fluorescència (FANS) per enriquir ARN nuclear, permetent un perfilat precís de l'ARN del compartiment nuclear. Aquesta anàlisi va revelar centenars de loci enriquits, incloent-hi ARN nuclears derivats de llocs d'empalmament (splice junctions) i ARN llargs no codificants antisentit (aslncRNA). A més, entre els ARN nuclears enriquits vam recuperar substrats units a DCL3, cosa que indica punts específics de convergència entre la localització dels transcrits i l'accessibilitat a DCL3. Aquest treball aporta avenços conceptuals i tècnics per a la identificació dels substrats endògens de DCL3 i amplia la nostra comprensió de la biogènesi dels sRNA més enllà dels paradigmes canònics de silenciació. |
|---|