Desarrollo de aptasensores para la detección de bacterias enteropatógenas
[spa] El objetivo general de esta tesis doctoral fue el desarrollo de biosensores basados en aptámeros para la detección de bacterias enteropatógenas. Para ello se estudiaron diferentes estrategias de detección gracias a las propiedades únicas de los aptámeros, tales como su capacidad de adoptar dif...
| Autor: | |
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| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2017 |
| País: | España |
| Institución: | Universidad de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de la UB |
| OAI Identifier: | oai:diposit.ub.edu:2445/119143 |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/2445/119143 http://hdl.handle.net/10803/460682 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Electroquímica Bacteris Àcids nucleics Biosensors Electrochemistry Bacteria Nucleic acids |
| Sumario: | [spa] El objetivo general de esta tesis doctoral fue el desarrollo de biosensores basados en aptámeros para la detección de bacterias enteropatógenas. Para ello se estudiaron diferentes estrategias de detección gracias a las propiedades únicas de los aptámeros, tales como su capacidad de adoptar diferentes estructuras conformacionales tras el enlace con la molécula diana, su estabilidad y la facilidad con que se pueden modificar químicamente, introduciendo marcajes o ciertos grupos funcionales. Las bacterias utilizadas en todas las estrategias de detección fueron: Salmonella typhimurium (diana del aptámero seleccionado, específicamente las proteinas transportador ABC, OmpA y precursor OmpD), Eschericia coli O157 Shiga, Shigella sonnei, Escherichia coli k5, Proteus mirabilis, Bacillus cereus y Kocuria lutea. En la primera fase de la tesis se realizó la caracterización de la bacteria Salmonella typhimurium y de la afinidad del aptámero por este microorganismo. La afinidad del aptámero por la bacteria se comprobó utilizando las técnicas de impresión por microcontacto (μCP), la microscopía de fuerza atómica (AFM) y la microscopía de fluorescencia. Posteriormente en la fase siguiente se desarrolló un sistema de detección basado en partículas magnéticas como plataforma de captura, preconcentración y detección basada en un ensayo competitivo indirecto. Se llevó a cabo la detección colorimétrica, por absorbancia, y electroquímica, por voltametría de pulso diferencial (DPV). En ambas alternativas de detección se observó reactividad cruzada de la bacteria Salmonella typhimurium con E. coli O157 Shiga y con Shigella sonnei, no presentándose dicha reactividad con las otras bacterias. El porcentaje de similitud de las proteinas diana análogas fue mayor en relación a las proteinas correspondientes a E. coli O157 Shiga y Shigella sonnei, y menor respecto a las proteinas análogas de las otras bacterias. En la tercera fase de la tesis se desarrollaron dos biosensores electroquímicos. Uno basado en la detección directa del enlace con la bacteria por espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS). El otro biosensor se basó en la inhibición enzimática causada por el cambio conformacional del aptámero tras su enlace con la bacteria. En este caso se utilizó la técnica electroquímica DPV para medir la actividad de la enzima fosfatasa alcalina. Con el primero se lograron los mejores resultados, por cuanto los parámetros de comportamientos fueron los mejores (menor LOD, mayor sensibilidad, menor tiempo de análisis), pero además es una estrategia en la cual la construcción del aptasensor es simple puesto que consta de un solo paso. Finalmente los ensayos de selectividad llevados a cabo en todas las estrategias de detección muestran que todos los sistemas de detección fueron capaces de discriminar el grupo de bacterias clasificadas como enteropatógenos (Salmonella typhimurium, Escherichia coli O157 Shiga y Shigella sonnei) del resto de bacterias (Escherichia coli k5, Proteus mirabilis, Bacillus cereus y Kocuria lutea), demostrando que la afinidad del aptámero por Salmonella typhimurium no es específica para esta bacteria, sino que también existe una afinidad equivalente por E. coli O157 Shiga y Shigella sonnei. |
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