Development of antibody-based antitumor therapies based on Trastuzumab: antibody-drug conjugates, immunocytokines and fragment conjugates
La tesi està centrada en el desenvolupament de molècules terapèutiques basades en anticossos per al tractament de càncer de mama HER2 positiu. Les molècules generades consisteixen en anticossos conjugats a drogues (ADCs) i una immunocitoquina, totes aquestes molècules basades en l’anticòs monoclonal...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de documento: | tese |
| Estado: | Versão publicada |
| Data de publicação: | 2019 |
| País: | España |
| Recursos: | CBUC, CESCA |
| Repositório: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/669342 |
| Acesso em linha: | http://hdl.handle.net/10803/669342 |
| Access Level: | Acceso aberto |
| Palavra-chave: | Anticossos conjugats a drogues Anticuerpos conjugados a drogas Antibody-drug conjugates Anticòs anti-HER 2 Anticuerpo anti-HER2 Anti-HER2 antibody Bioconjugació Bioconjugación Bioconjugation Tecnologies 577 |
| Resumo: | La tesi està centrada en el desenvolupament de molècules terapèutiques basades en anticossos per al tractament de càncer de mama HER2 positiu. Les molècules generades consisteixen en anticossos conjugats a drogues (ADCs) i una immunocitoquina, totes aquestes molècules basades en l’anticòs monoclonal model Trastuzumab. Aquest treball comprèn el procés producció i caracterització de les molècules, partint del clonatge de les seqüències dels anticossos i anant fins l’anàlisi in vitro de la seva activitat antiproliferativa, i, per a un dels candidats desenvolupats, analitzant també el seu potencial terapèutic in vivo. Com a primer pas, l’anticòs de referència Trastuzumab ha estat produït mitjançant la línia cel·lular HEK293, s’ha caracteritzat la producció a escala matràs així com en sistemes d’un sol ús de 5 i 50 litres. També s’ha definit una seqüència d’operacions per a la recuperació i purificació del producte, amb la qual s’ha obtingut una puresa de l’ordre del 99%. Així mateix, s’han implementat eines per a la caracterització fisicoquímica del producte obtingut. Les estratègies de producció, purificació i caracterització desenvolupades per a l’anticòs Trastuzumab han estat aplicades a la resta de molècules derivades d’anticòs, produïdes posteriorment. En un primer intent per a desenvolupar molècules derivades de Trastuzumab amb una activitat terapèutica incrementada, l’anticòs Trastuzumab ha estat fusionat a la citoquina interferó-2, en forma d’immunocitoquina. Aquest constructe, però, no ha generat una activitat antiproliferativa més potent que la del Trastuzumab, ni tampoc ha resultat en una activació del sistema immunitari. Ambdues activitats han estat analitzades en assajos in vitro. L’increment de la potència antiproliferativa de l’anticòs Trastuzumab ha estat aconseguida a través de la seva conjugació a les drogues citotòxiques DM1 i vcMMAE, amb ràtios droga-anticòs (DAR) de 3.1 i 4, respectivament. Aquesta estratègia implica l’aplicació de dos dels principals mètodes de conjugació de referència, utilitzats en ADCs aprovats comercialment: conjugació a residus endògens de l’anticòs de lisina (DM1) i de cisteïna, després d’una reducció parcial (vcMMAE). També s’han aplicat estratègies de conjugació dirigida, les quals generen ADCs homogenis, que presenten un índex terapèutic més favorable. Tres estratègies diferents han estat implementades per la conjugació homogènia de l’anticòs Trastuzumab. En una primera estratègia, l’anticòs ha estat conjugat a la droga vcMMAE amb un DAR objectiu de 8, mitjançant una reducció completa de l’anticòs. DARs elevats, però, poden causar inestabilitat de la molècula i perjudicar-ne l’efecte in vivo. Així, s’ha realitzat la conjugació homogènia amb un DAR objectiu de 2, a través de la inserció d’una cisteïna a la seqüència del Trastuzumab, la qual ha estat conjugada al vcMMAE, amb un DAR resultant d’1.79. També s’ha desenvolupat una estratègia innovadora per tal d’obtenir un ADC homogeni amb un DAR de 2, basada en la conjugació del residu de cisteïna de cadenes lleugeres produïdes independentment, després unides a cadenes pesades també produïdes independentment: s’obté un ADC homogeni amb un DAR de 2. Les estratègies de conjugació heterogènies i homogènies implementades per a l’anticòs Trastuzumab sencer han estat també aplicades a fragments scFv, en aquest cas, han resultat en processos amb un baix rendiment de recuperació a causa de la poca estabilitat dels conjugats. Els diversos ADCs generats en aquest treball han estat analitzats en models in vitro 2D amb la línia cel·lular SKBR3, model de càncer de mama, amb els quals s’ha confirmat el seu potencial anticancerós. També s’han desenvolupat models 3D, els quals han estat més resistents que els models 2D. Finalment, l’efecte terapèutic de l’ADC homogeni format per la unió de les cadenes independents ha demostrat una forta activitat terapèutica en un model de ratolí in vivo, validant, així, el procés de producció d’ADCs desenvolupat. |
|---|