The quasi-atomic structure of tyrosine hydroxylase by cryo-electron microscopy: functional implications

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 17-01-2020

Detalles Bibliográficos
Autor: Bueno Carrasco, María Teresa
Tipo de recurso: tesis doctoral
Fecha de publicación:2020
País:España
Institución:Universidad Autónoma de Madrid
Repositorio:Biblos-e Archivo. Repositorio Institucional de la UAM
Idioma:inglés
OAI Identifier:oai:repositorio.uam.es:10486/691887
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/10486/691887
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Enzimas - Efectos fisiológicos - Tesis doctorales
Tirosinas - Patologías neurológicas - Tesis doctorales
Biología y Biomedicina / Biología
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Cuéllar Pérez, Jorge
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spelling The quasi-atomic structure of tyrosine hydroxylase by cryo-electron microscopy: functional implicationsBueno Carrasco, María TeresaEnzimas - Efectos fisiológicos - Tesis doctoralesTirosinas - Patologías neurológicas - Tesis doctoralesBiología y Biomedicina / BiologíaTesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 17-01-2020Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 17-07-2021The aromatic amino acid hydroxylases (AAAHs) constitute a family of enzymes that catalyse the hydroxylation of aromatic amino acids using tetrahydrobiopterin (BH4) as cofactor and di-oxygen as additional substrate. Tyrosine hydroxylase (TH) is an AAAH that catalyses the conversion of L-tyrosine to L-DOPA, the first and rate-limiting step in the biosynthesis of catecholamine neurotransmitters (dopamine, noradrenaline and adrenaline). TH is a highly controlled enzyme, and the regulatory mechanisms include feed-back inhibition by catecholamine end products and phosphorylation at four different Ser/Thr sites. Mutations in TH are associated with a neuropsychiatric disorder characterized by a large reduction in dopamine and noradrenaline levels, and a metabolic phenotype that is also observed in the non-motor and motor symptoms of the neurodegenerative disease Parkinson’s disease (PD). TH is a 224 kDa homotetramer built by two dimers (D2 symmetry). Each subunit consists of a regulatory ACT domain with an unstructured N-terminal tail, a catalytic domain and a C-terminal oligomerization domain. To date, only structures of truncated forms of the protein are available, such as the crystal structure of the catalytic and oligomerization domains or the solution structure of regulatory domain. Improvements in the purification process and sample preparation have allowed to obtain an active, full-length TH with an intact N-terminus. In this work, we have used this kind of preparation to generate the structure of the full-length human TH at 3.4 Å resolution, by means of state-of-the-art cryoelectron microscopy. This structure confirms that the regulatory domain is in a dimeric form but shows slight differences with regard to the previous, partial structures of TH. A similar approach has been used to determine the structure of TH with dopamine bound to the active site, which in this case has served to visualise for the first time an a-helix of the unstructured, flexible N-terminal part, but which is found internalized in the active site. These structural changes serve to explain, in structural terms, the biochemical results obtained previously, and to have a more comprehensive understanding of the hydroxylation mechanism of TH and its regulatory properties.Las hidroxilasas de aminoácidos aromáticos (AAAHs) constituyen una familia de enzimas que catalizan la hidroxilación de aminoácidos aromáticos usando tetrahidrobiopterina (BH4) como cofactor y oxígeno como sustrato adicional. La tirosina hidroxilasa (TH) es una AAAH que cataliza la conversión de L-tirosina a L-DOPA, la primera reacción que constituye el paso limitante en la biosíntesis de catecolaminas (dopamina, noradrenalina y adrenalina). TH es una enzima altamente controlada, y los mecanismos de regulación incluyen inhibición por retroalimentación negativa mediante la unión de catecolaminas, y fosforilaciones en cuatro residuos Ser/Thr específicos. Mutaciones en TH se asocian a patologías neurológicas caracterizadas por una reducción en los niveles de dopamina y noradrenalina, y un fenotipo metabólico característico en síntomas motores y no motores observados en la enfermedad de Parkinson. TH es un homotetrámero de 224 kDa formado por dos dímeros con simetría D2. Cada subunidad está formada por un dominio ACT regulatorio con una región Nterminal desordenada, un dominio catalítico y un dominio de oligomerización en el extremo C-terminal. Hasta la fecha, solo versiones truncadas de la proteína han sido resueltas, como la estructura atómica de los dominios catalíticos y de oligomerización, o la de los dominios regulatorios. Mejoras en el proceso de purificación y en la preparación de las muestras de TH han permitido obtener una proteína activa y con un extremo N-terminal intacto. En este trabajo, hemos obtenido la estructura de TH humana completa a una resolución final de 3.4 Å mediante crio-microscopía electrónica. Esta estructura confirma que el dominio regulatorio dimeriza pero muestra ligeras diferencias con respecto a estructuras parciales previas de TH. Procedimientos similares se han utlizado para determinar la estructura de TH con dopamina unida a su centro activo, en la cual se ha visto por primera vez la a-hélice del N-terminal desestructurado, la cual se internaliza en el sitio activo. Estos cambios estructurales explican los resultados bioquímicos obtenidos en trabajos previos, y ayudan a tener un mayor conocimiento sobre el mecanismo de hidroxilación de TH y sus propiedades regulatorias.Valpuesta Moralejo, Jose MariaCuéllar Pérez, JorgeDepartamento de Biología MolecularFacultad de Ciencias20202020-01-17doctoral thesishttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06NAhttp://purl.org/coar/version/c_be7fb7dd8ff6fe43info:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10486/691887reponame:Biblos-e Archivo. 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