Advances in post-thawing protocol of cryopreserved endangered Catalonian breed (Cabra Blanca de Rasquera) sperm doses towards improving their post-thawed fertility potential
La Cabra Blanca de Rasquera és una raça autòctona catalana en perill d'extinció de la zona sud de Catalunya. Per a mantenir la seva existència, l'Organització de les Nacions Unides per a l'Alimentació i la Agricultura (FAO) recomana per a la conservació de les races catalogades en ris...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2022 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglés |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:265838 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/265838 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Semen Crioconservació Crioconservación Cryopreservation Cabrum Caprino Goat Ciències de la Salut |
| Sumario: | La Cabra Blanca de Rasquera és una raça autòctona catalana en perill d'extinció de la zona sud de Catalunya. Per a mantenir la seva existència, l'Organització de les Nacions Unides per a l'Alimentació i la Agricultura (FAO) recomana per a la conservació de les races catalogades en risc d'extinció establir programes de conservació tant in situ com ex situ (FAO, 2010). Els programes de conservació ex situ com és la crioconservació espermàtica i la creació de bancs de germoplasma permeten l'emmagatzematge del semen indefinidament a través de varis processos com la recollida de semen i la seva congelació per a la seva posterior utilització en les diferents Tecnologies de Reproducció Assistida (ART), les quals són de gran importància en la conservació de la diversitat genètica en aquestes races. No obstant, millorar la qualitat dels espermatozoides descongelats en aquesta espècie és encara una gran preocupació. Diferents estratègies tecnològiques han estat proposades per assolir una millor qualitat seminal després de la descongelació, utilitzant varies tècniques com l'anàlisi informatitzat de la motilitat espermàtica (Computer Assisted Sperm Analysis, CASA), assajos sobre l'estructura de la cromatina espermàtica (Sperm Chromatin Structural Assay, SCSA), així com altres anàlisis realitzats a través de la utilització del citòmetre de flux per a valorar les distintes característiques espermàtiques. Per tant, la principal meta d'aquesta tesi doctoral ha estat establir nous enfocs en els protocols post-descongelació de les dosis espermàtiques crioconservades del banc de la raça autòctona Cabra Blanca de Rasquera en perill d'extinció amb l'objectiu de millorar la seva viabilitat i fertilitat després de la descongelació. En la present tesi, s'ha avaluat l'efecte de la tècnica de centrifugació en capa única (Single Layer Centrifugation, SLC) usant la solució de col·loide comercial Bovipure®, sobre la qualitat espermàtica després la descongelació en relació a varis factors com la edat del donant, l'estació de la recollida del semen i l'administració d'implants de melatonina en els mascles en la època no reproductiva. L'objectiu va ser determinar si la centrifugació a través del col·loide Bovipure® pot seleccionar espermatozoides viables amb bones habilitats cinètiques, ADN intacte, mitocòndries actives i integritat de membranes plasmàtica i acrosomal, dels espermatozoides de mala qualitat, morts o moribunds després de la descongelació amb la finalitat de mimetitzar el mateix procés observat en la selecció natural que passa en el tracte reproductor femení. Per això, en aquest estudi, es recolliren 2 ejaculats/mascle/dia (n = 6 dies) via vagina artificial de 6-8 mascles durant 2 anys consecutius en el període reproductiu i no reproductiu a l'edat de 12 i 24 mesos a la tardor i de 18 y 30 mesos d'edat en primavera. Prèvia a la recollida de semen en el període no reproductiu, els mascles van ser repartits al atzar en 2 grups (4 mascles/grup): a un grup se'ls administrà implants subcutanis de melatonina mentre que a l'altre grup romandrà sense tractar. Després des descongelar, els resultats de viabilitat espermàtica total i el percentatge d'espermatozoides amb acrosoma intacte i mitocòndries actives mostraren valors significativament superiors en les mostres recollides a la tardor comparat amb les mostres de primavera. No obstant, aquestes diferències no es van reflectir després de realitzar la tècnica SLC. Respecte a la integritat de l'ADN, no es varen observar diferències significatives post-descongelació, encara que la proporció d'espermatozoides amb HDS (Alta estabilitat de l'ADN) fou superior en les mostres seminals recollides durant la tardor. Referent als paràmetres cinètics, la motilitat progressiva fou significativament superior també durant la tardor comparat amb les mostres recollides en primavera una vegada descongelades. No obstant, aquestes diferències desaparegueren després de portar a terme la centrifugació (SLC) de les distintes mostres. Finalment, no s'observaren grans diferències significatives entre les mostres seminals no seleccionades i les que foren sotmeses a la tècnica SLC respecte a la motilitat total i progressiva, viabilitat, activitat mitocondrial y la integritat acrosomal i de l'ADN, el que demostra que la centrifugació simple a través del col·loide Bovipure® dels espermatozoides descongelats no millora la seva qualitat, independientement de l'edat del mascle, l'estació durant la que se realitzà la recollida del semen o l'administració de implants de melatonina als mascles. A més, aquest treball ha avaluat l'efecte d'incubar les distintes mostres seminals descongelades sota condicions capacitants durant 3 hores per a intentar simular la supervivència dels espermatozoides descongelats durant la migració activa en el tracte reproductor femení, en relació a la edat del donant, estació de l'any de la recollida del semen o l'aplicació d'implants de melatonina en l'època no reproductiva. Per altra banda, el paper del plasma seminal ha estat extensament estudiat per diferents grups, el qual proporciona una font de nutrients per als espermatozoides, millora la motilitat espermàtica i prevé l'activació prematura de l'espermatozoide durant la seva migració pel tracte femení. Pel que l'adició de plasma seminal als espermatozoides descongelats podria ser implementada com una alternativa per a millorar la qualitat seminal. Així, en la present tesi, també s'ha avaluat l'adició d'un 20% de plasma seminal en el medi durant la incubació de 3h sota condicions capacitants amb la finalitat de millorar la qualitat espermàtica post-descongelació. No obstant, els resultats obtinguts mostraren una significativa reducció de la motilitat i viabilitat espermàtica i l'activitat mitocondrial, així com també de la integritat de l'acrosoma després 3 h d'incubació sota condiciones in vitro de capacitació, independentment de la presencia de plasma seminal en el medi, mentre que la integritat de l'ADN no es va veure afectada. Aquests resultats semblen indicar que l'adició de plasma seminal no és útil com estratègia per a millorar la qualitat dels espermatozoides descongelats de boc, independentment dels factors estudiats anteriorment citats. Així mateix, l'efecte del factor individual del donant sobre la qualitat seminal post-descongelació i sobre l'eficàcia de la tècnica de selecció SLC fou avaluat, ja que la habilitat de l'espermatozoide a sobreviure en el tracte genital femení pot variar en funció del mascle. Amb aquest objectiu, es recolliren a principis de l'hivern 2 ejaculats/mascle/dia (n = 6 dies) via vagina artificial de 6 mascles de la raça Cabra Blanca de Rasquera de aproximadament 2 anys d'edat. Després de realitzar els diferents anàlisis, poques diferències significatives foren observades després de la descongelació de les dosis individuals en la viabilitat espermàtica, activitat mitocondrial i integritat acrosomal entre els diferents mascles, mentre que, respecte a la integritat de l'ADN, motilitat total i progressiva, cap diferencia fou detectada entre donants. A més, després de realitzar la tècnica de la SLC, poques diferències individuals relacionades amb l'efectivitat d'aquest mètode foren observades, únicament 2 mascles dels 6 testats mostraren una reducció en el dany acrosomal de les dosis, mentre que en la resta de paràmetres seminals analitzats no se observaren diferències significatives entre individus després SLC. Finalment, les possibles variacions entre mascles poden també produir diferències en la congelabilitat del semen amb respecte a la seva supervivència en el tracte reproductiu femení. Alguns ejaculats poden contenir subpoblacions d'espermatozoides que difereixin en la seva capacitat fecundant i amb característiques peculiars a cada mascle (Gomes et al., 2020). Per aquest motiu, el darrer estudi de la present tesi se centrà en l'avaluació del factor individual-mascle sobre la qualitat espermàtica post-descongelació després de 3 hores d'incubació sota condicions in vitro de capacitació amb l'objectiu de determinar si la variabilitat individual pot veure's reflectida en la seva resposta a aquestes condicions en presencia o no de plasma seminal, intentant simular la supervivència en condicions in vivo. Els resultats indicaren molt poques diferències individuals en la motilitat, viabilitat, integritat acrosomal i funció mitocondrial darrera la incubació i que la presencia de plasma seminal va reduir significativament aquests paràmetres en tots els mascles, mentre que respecte a la integritat de l'ADN, diferències individuals foren menys evidents després de 3 hores d'incubació en els diferents medis, sent inexistents en presencia de plasma seminal. Així, a partir dels resultats obtinguts en la present tesi, podem concloure que les dosis seminals descongelades de la raça Blanca de Rasquera a partir d'ejaculats obtinguts a la tardor presenten millors qualitats que les obtingudes en primavera o hivern. A pesar d'això, altres factors com l'edat del donant o l'aplicació d'implants de melatonina durant l'estació no reproductiva no milloraren la qualitat seminal post-descongelació, així com tampoc el fet de sotmetre les mostres descongelades a un suposat procés de selecció espermàtica mitjançant la tècnica de SLC a través del col·loide Bovipure®. Aquesta absència de millora de la qualitat dels espermatozoides descongelats suggereix que aquesta tècnica de selecció espermàtica no és útil per a la seva aplicació en tecnologies de reproducció assistida en aquesta raça. Per últim, l'adició de plasma seminal en el medi durant la incubació de las dosis descongelades en condicions in vitro de capacitació tampoc millorà la qualitat espermàtica, pel que no sembla ser una alternativa efectiva para ser usada amb l'objectiu d'incrementar la viabilitat i fertilitat de les dosis crioconservades del banc de semen de la raça Cabra Blanca de Rasquera en programes d'inseminació artificial o en altres tecnologies de reproducció assistida. |
|---|