Caracterización molecular de un regulador transcripcional del tipo Mga-AtxA en Enterococcus faecalis

179 p.-34 fig.-7 tab.

Detalles Bibliográficos
Autor: Ruiz-Cruz, Sofía
Tipo de recurso: tesis doctoral
Fecha de publicación:2015
País:España
Institución:Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)
Repositorio:DIGITAL.CSIC. Repositorio Institucional del CSIC
OAI Identifier:oai:digital.csic.es:10261/138030
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/10261/138030
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Control transcripcional
Expresión génica
Enterococcus faecalis
Regulador global
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spelling Caracterización molecular de un regulador transcripcional del tipo Mga-AtxA en Enterococcus faecalisMolecular characterization of an Enterococcus faecalis transcriptional regulator of the Mga-AtxA familyRuiz-Cruz, SofíaControl transcripcionalExpresión génicaEnterococcus faecalisRegulador global179 p.-34 fig.-7 tab.[EN] INTRODUCTION AND OBJECTIVES The Gram-positive bacterium Enterococcus faecalis is a natural inhabitant of the human gastrointestinal tract. However, as an opportunistic pathogen, it is able to cause infections such as urinary tract infections, endocarditis, and bacteremia. Although the identification of virulence determinants increased considerably after the publication of the genome sequence of E. faecalis strain V583, a vancomycin-resistant clinical isolate (Paulsen et al., 2003), our understanding of the molecular mechanisms that control the virulence of this bacterium is still very limited. In general, global transcriptional regulators that activate and/or repress the transcription of multiple genes in response to specific environmental signals are essential in the adaptation of pathogenic bacteria to new host niches. Searching for homologies, we found that the EF3013 gene (named maEfa herein) of E. faecalis strain V583 encodes a protein (MAEfa; 482 residues) that has sequence similarity to global transcriptional regulators of the Mga/AtxA family. The enterococcal OG1RF genome also encodes the MAEfa protein (OG1RF_12293). The Mga/AtxA family includes the virulence regulators AtxA, Mga and MgaSpn from the Gram-positive pathogens Bacillus anthracis, Streptococcus pyogenes and Streptococcus pneumoniae, respectively. Such regulators control the expression of numerous genes and play an important role in the pathogenicity of these bacteria (Fouet, 2010; Hemsley et al., 2003; McIver, 2009; Solano-Collado et al., 2012). This Thesis has been focused on the functional characterization of MAEfa. To investigate whether MAEfa is a new member of the Mga/AtxA family of global regulators, we have worked on the following specific objectives: 1. Construction of promoter-probe and terminator-probe plasmid vectors in E. faecalis 2. Construction of expression plasmid vectors in E. faecalis 3. Analysis of maEfa gene expression in enterococcal cells 4. Purification of the MAEfa protein and analysis of its oligomerization state 5. Study of the interaction of MAEfa with linear double-stranded DNA 6. Analysis of the effect of MAEfa on global gene expression and virulenceRESULTS AND CONCLUSIONS 1. Plasmid-based genetic tools for E. faecalis Despite the increasing clinical significance of E. faecalis, the tools available for its genetic manipulation are still very scarce. We have constructed a promoter-probe vector (pAST) and a terminator-probe vector (pAS) based on the broad-host range plasmid pMV158. As reporter gene, a gfp allele (green fluorescent protein) was used. To analyse the functionality of these vectors, we inserted promoter and terminator signals into pAST and pAS, respectively. We demonstrated by fluorescence assays that both vectors are suitable to assess the activity of promoters and terminators (both homologous and heterologous) not only in E. faecalis but also in S. pneumoniae. In addition we have developed two expression vectors based on the broad-host range plasmid pDL287: vector pDLF carries an enterococcal promoter (P2493) and vector pDLS carries a pneumococcal promoter (PsulA). The usefulness of these vectors was confirmed by cloning the maEfa gene. 2. In vivo transcription of the enterococcal maEfa gene By RT-PCR experiments, we have demonstrated that the maEfa gene is transcribed in different E. faecalis strains (V583, OG1RF and JH2-2) under standard bacterial growth conditions Using in vivo approaches such as promoter-reporter fusions (plasmid pAST-Pma) and primer extension experiments we identified the promoter (Pma) of the maEfa gene. Its transcription initiation site is located 15 nucleotides upstream of the predicted translation codon. Moreover, using the terminator-probe vector pAS, we found that there is a functional transcriptional terminator upstream of the Pma promoter. 3. Features of the MAEfa protein We have set up a protocol to overproduce and purify an untagged form of the MAEfa protein. It involved essentially four steps: (i) nucleic acids and MAEfa were precipitated with polyethylenimine (PEI) at a low ionic strength; (ii) MAEfa was eluted from the PEI pellet using a higher ionic strength buffer; (iii) the sample was subjected to heparin affinity chromatography, and (iv) the protein preparation was loaded onto a gelfiltration column. By gel filtration chromatography and analytical ultracentrifugation experiments we demonstrated that MAEfa form dimers in solution.4. Interaction of the MAEfa protein with DNA The interaction of MAEfa with linear double-stranded DNA was analysed by electrophoretic mobility shift assays (EMSA) and DNase I footprinting. By EMSA, we have shown that: (i) MAEfa is able to generate multimeric complexes on linear doublestranded DNA, (ii) MAEfa binds to linear double-stranded DNA with little or no sequence specificity, (iii) a His-tagged MAEfa protein (MAEfa-His) also forms multiple DNA-protein complexes, and (iv) the minimum DNA size required for MAEfa binding is between 26 bp and 32 bp. Moreover, by DNase I footprinting assays using DNA fragments that contain the Pma promoter we have shown that MAEfa recognizes preferentially a site located upstream of Pma. This site has a potential intrinsic curvature. The presence of such a binding site on a Pma-gfp transcriptional fusion does not affect the activity of Pma in cells overproducing MAEfa (cells carrying pASTPma and pDLFmaEfa; fluorescence assays). 5. Effect of MAEfa on global gene expression and virulence To investigate whether MAEfa functions as a global transcriptional regulator, we constructed an OG1RF derivative that is not able to synthesize MAEfa (OG1RFΔmaEfa). By genome-wide microarrays, quantitative RT-PCR assays, and complementation studies we have shown that MAEfa influences positively the transcription of numerous genes. Many of them encode components of PTS-type transporters, components of ABC-type transporters, and proteins involved in the metabolism of carbon sources. Associated to this fact, the growth of the maEfa deletion mutant strain is impaired in media containing glycerol, maltose or mannitol. Furthermore, the potential role of MAEfa in virulence was studied at the Helmholtz Centre for Infection Research under the supervision of Dr. Oliver Goldmann. Using a mouse peritonitis infection model, we found that the OG1RFΔmaEfa strain induces a significant lower degree of inflammation in the peritoneal cavity of mice compared to the wild-type strain. Thus, E. faecalis cells deficient in MAEfa are less virulent. Our results suggest that MAEfa facilitates the adaptation of E. faecalis to particular host niches through the transcriptional regulation of numerous genes and consequently, it contributes to its potential virulence.[ES] INTRODUCCIÓN Enterocococcus faecalis es una bacteria Gram-positiva que se encuentra de forma comensal en el tracto gastrointestinal humano. Sin embargo, como patógeno oportunista puede causar graves infecciones como endocarditis y bacteriemia. En esta bacteria, la identificación de factores de virulencia aumentó considerablemente tras la publicación de la secuencia del genoma de la estirpe V583 (Paulsen et al., 2003). Sin embargo, el conocimiento de los mecanismos moleculares que controlan su virulencia sigue siendo escaso. En general, los reguladores globales que modulan la transcripción de múltiples genes en respuesta a señales ambientales específicas son esenciales en la adaptación de las bacterias patógenas a nichos particulares del hospedador. Mediante búsquedas en las bases de datos, encontramos que el gen EF3013 (llamado maEfa en este trabajo) de E. faecalis V583 codifica una proteína (MAEfa) que presenta similitud de secuencia con los reguladores globales de la familia Mga/AtxA. La estirpe OG1RF también codifica la proteína MAEfa (OG1RF_12293). La familia Mga/AtxA incluye a los reguladores de virulencia AtxA, Mga y MgaSpn de las bacterias Gram-positivas patógenas Bacillus anthracis, Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae, respectivamente. Dichos reguladores controlan la expresión de numerosos genes y están implicados en la patogénesis de estas bacterias (Fouet, 2010; Hemsley et al., 2003; McIver, 2009; Solano-Collado et al., 2012). El trabajo de investigación presentado en esta Tesis ha estado centrado en la caracterización funcional de la proteína MAEfa de E. faecalis. OBJETIVOS Para determinar si MAEfa es un nuevo miembro de la familia Mga/AtxA de reguladores globales, hemos desarrollado los siguientes objetivos específicos: 1. Construcción de vectores plasmídicos para ensayar promotores y terminadores transcripcionales en E. faecalis 2. Construcción de vectores de expresión para E. faecalis basados en plásmidos 3. Análisis de la expresión del gen maEfa en células enterocócicas 4. Purificación de la proteína MAEfa y análisis de su estado de oligomerización 5. Estudio de la interacción de MAEfa con DNA lineal de cadena doble 6. Análisis del efecto de MAEfa en expresión génica global y virulenciaAPORTACIONES FUNDAMENTALES Y CONCLUSIONES 1. Herramientas genéticas para E. faecalis basadas en plásmidos A pesar del creciente interés clínico en E. faecalis, las herramientas disponibles para su manipulación genética son limitadas. Por ello, hemos construido un vector que permite ensayar promotores (plásmido pAST) y un vector que permite ensayar terminadores transcripcionales (plásmido pAS), ambos basados en el plásmido promiscuo pMV158 (del Solar et al., 1993). El gen reportero utilizado es una variante del gen gfp (proteína fluorescente verde). Para analizar la funcionalidad de estos vectores, insertamos diferentes señales promotoras y terminadoras en pAST y pAS, respectivamente. Mediante ensayos de fluorescencia demostramos que ambos vectores son de gran utilidad para evaluar la actividad de promotores y terminadores (ya sean homólogos o heterólogos) tanto en E. faecalis como en S. pneumoniae. Además, hemos desarrollado dos vectores de expresión (pDLF y pDLS) para E. faecalis basados en pDL287, un plásmido de amplio espectro de huésped (LeBlanc et al., 1993). El vector pDLF contiene un promotor de E. faecalis (P2493) y el vector pDLS contiene un promotor de S. pneumoniae (PsulA). La funcionalidad de estos vectores se confirmó mediante el clonaje del gen maEfa. 2. Transcripción in vivo del gen maEfa Mediante experimentos de RT-PCR, hemos demostrado que hay transcripción del gen maEfa en diferentes estirpes de E. faecalis (V583, OG1RF y JH2-2) cuando las bacterias crecen en condiciones de laboratorio estándar. A partir de aproximaciones in vivo tales como el uso de fusiones transcripcionales (plásmido pAST-Pma) y experimentos de primer extension, hemos identificado: (i) el promotor del gen maEfa (Pma) y (ii) el inicio de transcripción de maEfa, que está localizado 15 nucleótidos upstream del codón de inicio predicho. Además, utilizando el vector pAS confirmamos que el promotor Pma está precedido por un terminador transcripcional intrínseco.3. Características de la proteína MAEfa Hemos establecido un protocolo para sobreproducir y purificar la proteína MAEfa. El protocolo de purificación consiste esencialmente en cuatro etapas: (i) precipitación de los ácidos nucleicos y MAEfa con polietilenimina (PEI) a baja fuerza iónica; (ii) elución de MAEfa del pellet de PEI empleando un tampón de mayor fuerza iónica; (iii) cromatografía de afinidad utilizando columnas de heparina y (iv) cromatografía de filtración en gel. Mediante ensayos de filtración en gel y experimentos de ultracentrifugación analítica, demostramos que MAEfa forma dímeros en solución. 4. Interacción de la proteína MAEfa con DNA Hemos analizado la interacción de MAEfa con DNA lineal de cadena doble mediante ensayos de retraso en gel (EMSA) y experimentos de protección frente a la digestión con DNasa I. Mediante EMSA mostramos que: (i) MAEfa genera complejos multiméricos sobre DNA lineal de cadena doble; (ii) MAEfa no parece reconocer una secuencia nucleotídica específica cuando interacciona con DNA lineal de cadena doble y (iii) MAEfa-His, una versión de MAEfa con cola de histidinas, también forma múltiples complejos proteína-DNA. En los ensayos de digestión con DNasa I, utilizamos fragmentos que contenían el promotor Pma. En dichos fragmentos, MAEfa reconoce preferentemente un sitio localizado upstream del promotor. Este sitio contiene una curvatura intrínseca potencial. 5. Efecto de MAEfa en expresión génica global y virulencia Para investigar si MAEfa funciona como un regulador global, construimos la estirpe OG1RFΔmaEfa, un derivado de OG1RF que carece del gen maEfa. Mediante análisis de microarrays, RT-PCR cuantitativa y estudios de complementación, mostramos que MAEfa influye positivamente en la transcripción de numerosos genes. Muchos de ellos codifican componentes de transportadores PTS, componentes de transportadores ABC y proteínas implicadas en el metabolismo de fuentes de carbono. Asociado a este hecho, el crecimiento de la estirpe OG1RFΔmaEfa está afectado en medios de cultivo que contienen glicerol, maltosa o manitol. Además, estudiamos el papel de MAEfa en virulencia. Este estudio fue realizado en el Helmholtz Centre for Infection Research bajo la supervisión del Dr. Oliver Goldmann. Empleando un modelo de peritonitis murina descubrimos que la estirpe OG1RFΔmaEfa induce menor inflamación en la cavidad peritoneal comparada con la estirpe OG1RF. Nuestros resultados sugieren que MAEfa facilita la adaptación de E. faecalis controlando la transcripción de numerosos genes y, en consecuencia, contribuye a su posible virulencia.Beca FPU AP2008-00105 del Ministerio de Educacion. Proyectos: (CCG08-CSIC/SAL-3694) de la Comunidad de Madrid; (CSD2008-00013-INTERMODS, BFU2009-11868, BIO2013-49148-C2-2-R) de los Ministerios Ciencia e Innovación y Economía y Competividad; (PIE-201320E028).Peer reviewedCSIC - Centro de Investigaciones Biológicas Margarita Salas (CIB)Universidad Complutense de MadridBravo, AliciaMinisterio de Educación, Cultura y Deporte (España)Ministerio de Ciencia e Innovación (España)Ministerio de Economía y Competitividad (España)Consejo Superior de Investigaciones Científicas [https://ror.org/02gfc7t72]201620162015info:eu-repo/semantics/doctoralThesishttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06http://hdl.handle.net/10261/138030reponame:DIGITAL.CSIC. 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