The use of bacteriophages for the detection of bacteria in environmental water samples
Segons l'OMS (Organització Mundial de la Salut), la contaminació fecal d'aigua potable afecta més de 2.000 milions de persones a tot el món i provoca més de 500.000 morts cada any. L'estratègia actual per al control de la qualitat microbiològica de l'aigua depenen en gran mesura...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2022 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglés |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:265809 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/265809 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | ß-Galactosidasa ß-Galactosidase Detecció bacteriana Detección bacteriana Bacterial detection Bacteriòfag Bacteriófago Bacteriophage Ciències Experimentals |
| Sumario: | Segons l'OMS (Organització Mundial de la Salut), la contaminació fecal d'aigua potable afecta més de 2.000 milions de persones a tot el món i provoca més de 500.000 morts cada any. L'estratègia actual per al control de la qualitat microbiològica de l'aigua depenen en gran mesura de l'ús de mètodes de cultiu ben validats que proporcionen bons resultats, però que requereixen temps llargs d'incubació. La tendència en aquest camp ha estat la introducció progressiva de mètodes alternatius ràpids que proporcionen resultats en una fracció del temps i permeten una gestió més àgil dels riscs associats a l'aigua de consum. Aquests mètodes inclouen aproximacions basades en la utilització d'àcids nucleics (PCR, qPCR), reaccions basades en anticossos o aptàmers (ELISA) o assajos enzimàtics específics (ATPasa, ß-galactosidasa, ß-glucuronidasa). Tot i que aquests mètodes ofereixen un resultat força bo, sovint pateixen d'una sèrie d'inconvenients. En la majoria dels casos, els mètodes requereixen reactius cars, l'ús d'equips sofisticats o la participació de personal altament qualificat. Per tant, la cerca d'un mètode senzill, ràpid i específic per a la detecció d'E. coli en mostres d'aigua continua oberta. Aquesta tesi intenta contribuir a aquesta cerca desenvolupant un mètode basat en enzims que utilitza un assaig inespecífic per β-galactosidasa optimitzat per proporcionar una detecció específica d'E. coli mitjançant l'ús d'un bacteriòfag T4. L'optimització de l'assaig de ß-galactosidasa per aconseguir la màxima sensibilitat ha requerit la determinació de valors òptims per als principals paràmetres que afecten el seu rendiment. Els resultats proporcionen una estima aproximada de com la desviació dels valors òptims redueix el rendiment de l'assaig i disminueix la seva sensibilitat. L'assaig optimitzat requereix la inducció de les mostres mitjançant IPTG 0.2 mM durant 180 minuts. La permeabilització de les mostres és necessària, ja que la seva absència provoca una reducció de gairebé el 60% en el rendiment de l'assaig. L'elecció del substrat enzimàtic és fonamental ja que diferents substrats produeixen productes amb diferents coeficients d'extinció o rendiments de fluorescència. La concentració del substrat utilitzat ha de ser prou elevada (al voltant de 3 a 4 vegades Km) per garantir que l'activitat mesurada no estigui limitada pel substrat. Finalment, com que el color / fluorescència dels productes de reacció depèn molt del pH, s'ha de procurar que el pH en el moment de la lectura sigui prou elevat per proporcionar la màxima senyal. L'assaig es realitza en plaques de 96 pous, utilitza MUG (4-metilumberliferil-ß-D-galactopiranosid) com a substrat enzimàtic i té una durada total de 90 minuts. El mètode és capaç de detectar 75 cèl·lules d'E. coli. En les condicions de l'assaig, això correspon a una concentració d'1.49·10^3 cèl·lules·mL-1 de mostra. Per a l'anàlisi de mostres de camp es va desenvolupar una versió ampliada de l'assaig que incorpora passos de preconcentració i preincubació amb una durada total de 7.5 hores. Quan es va provar amb mostres de camp i es va comparar amb Colilert-18, el mètode ampliat va tenir un bon rendiment amb un límit de detecció de 96 cèl·lules·100 mL-1. L'assaig és robust i es pot modificar per adaptar-lo a formats més fàcils d'utilitzar, com ara un assaig en paper. |
|---|