Degradación de aminas biogénicas y poliaminas en "Pseudomonas putida U"

268 p.

Bibliographic Details
Author: Getino Alonso, Luis
Format: doctoral thesis
Publication Date:2025
Country:España
Institution:Universidad de León
Repository:BULERIA. Repositorio Institucional de la Universidad de León
OAI Identifier:oai:buleria.unileon.es:10612/25585
Online Access:https://hdl.handle.net/10612/25585
Access Level:Open access
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Microbiología
Metabolismo bacteriano
Genética
Bioquímica
2415 Biología Molecular
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Rodríguez Olivera, Elías
Bioquimica y Biologia Molecular
Facultad de Ciencias Biologicas y Ambientales
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spelling Degradación de aminas biogénicas y poliaminas en "Pseudomonas putida U"Degradation of biogenic amines and polyamines in "Pseudomonas putida U"Getino Alonso, LuisBiologíaMicrobiologíaMetabolismo bacterianoGenéticaBioquímica2415 Biología Molecular2414 Microbiología2409 Genética2403 Bioquímica268 p.[ES] Las aminas biogénicas tienen una gran relevancia en la seguridad alimentaria debido a su implicación en numerosas intoxicaciones alimentarias. Cada año, miles de personas en todo el mundo sufren los efectos adversos de la ingestión de alimentos en mal estado, lo que genera importantes problemas de salud pública. En particular, la histamina y la tiramina han sido identificadas como las principales aminas biogénicas responsables de reacciones adversas, incluyendo crisis hipertensivas y síntomas gastrointestinales severos. La presencia de niveles elevados de aminas en productos fermentados, pescados y carnes procesadas ha llevado a la implementación de normativas más estrictas en la industria alimentaria. Las aminas biogénicas son compuestos nitrogenados derivados de la descarboxilación de aminoácidos que se encuentran de manera natural en organismos vivos y desempeñan funciones esenciales en ellos. Estos compuestos tienen un impacto directo sobre el metabolismo humano, ya que pueden actuar como neurotransmisores, moduladores del sistema inmune o precursores de otras biomoléculas. Sin embargo, cuando se acumulan en concentraciones elevadas en los alimentos, pueden desencadenar efectos tóxicos en los consumidores, especialmente en personas con deficiencias en las enzimas encargadas de su degradación. La presencia de aminas biogénicas en los alimentos es un fenómeno ampliamente documentado. Se encuentran principalmente en productos fermentados, como quesos, embutidos, vino y cerveza, debido a la actividad microbiana que transforma los aminoácidos presentes en la materia prima. También se detectan en pescados y mariscos mal conservados, donde la proliferación de bacterias provoca un aumento significativo de estas. La regulación de su concentración en estos productos es un desafío importante para la industria alimentaria, que debe aplicar estrictos controles de calidad para evitar riesgos de intoxicación. A lo largo de los años, diversos estudios han abordado el catabolismo de las aminas biogénicas en distintos organismos. En humanos y animales, las amino oxidasas desempeñan un papel crucial en su degradación. En el ámbito microbiano, múltiples especies bacterianas han demostrado ser capaces de metabolizar aminas biogénicas, lo que ha despertado un gran interés en su posible aplicación biotecnológica. Entre estas especies, Pseudomonas putida U destaca por su versatilidad metabólica y su capacidad para utilizar diferentes compuestos químicos como fuente de carbono y energía, lo que la convierte en un excelente modelo de estudio para comprender mejor los mecanismos de catabolismo de estas sustancias y explorar su potencial en la eliminación de compuestos tóxicos en alimentos. Mediante técnicas avanzadas de secuenciación genómica se ha obtenido la secuencia completa del genoma de P. putida U. Esto ha permitido situar dentro de él los puntos de inserción del Tn5 de todos los mutantes previamente obtenidos por nuestro grupo de investigación. Así mismo, utilizando este mismo transposón, se han aislado diferentes mutantes afectados en el metabolismo de diferentes compuestos. Los mutantes afectados en el catabolismo del propionato (prpC y PPU_10225) han revelado el papel que estos juegan en la degradación de monoaminas alifáticas y ácidos grasos con un numero impar de carbonos. La inserción del transposón Tn5 en el gen dadA y dadR, genes implicados en el metabolismo de alanina, son esenciales para que P. putida U crezca utilizando la cadaverina como única fuente de carbono y energía, mientras que HinI, una aspartato aminotransferasa, está implicada en el catabolismo de ácido Delta-aminovalérico. El gen gltA, que codifica la citrato sintasa en Pseudomonas también ha demostrado tener un papel importante en el catabolismo de monoaminas alifáticas y aromáticas, así como de ácidos grasos de entre 3 y 5 átomos de carbono, ácido fenilacético y ácido Delta-aminovalérico. Finalmente, la mutagénesis utilizando el transposón Tn5 ha permitido identificar los genes implicados en el transporte y metabolismo de poliaminas en P. putida U. Los estudios del transcriptoma de P. putida U utilizando putrescina o cadaverina como única fuente de carbono y energía ha permitido identificar 1770 y 2292 genes con expresión diferencial. Así mismo, se ha estudio la expresión de los presuntos genes implicados en la desaminación de putrescina y cadaverina, encontrándose que spuC1 se sobreexpresa en presencia de ambas aminas y revelando la existencia de un segundo gen spuC2 cuya expresión se ve incrementada únicamente por la adición de cadaverina al medio, pero no por putrescina o los intermediarios metabólicos es estas poliaminas. En lo referente al catabolismo de los ácidos Gamma-aminobutírico y Delta-aminovalérico se ha demostrado que de los 3 presuntos genes implicados en su desaminación (gabT1-T3) únicamente gabT1 se sobreexpresa en presencia de estos ácidos o sus aminas precursoras (putrescina y cadaverina, respectivamente). La triptamina es una amina biogénica cuyo catabolismo por parte de microorganismos aún no ha sido estudiado. P. putida U es incapaz de utilizar el aminoácido triptófano o la triptamina (amina derivada de este) para sustentar su crecimiento. Sin embargo, la adición de otra fuente de carbono permite que, a través del sistema TynBA, implicado en la desaminación de tiramina, se genere ácido indol-3-acético. Este compuesto se ha testado sobre Cucumis sativus y Nicotiana tabacum, observándose la inducción de raíces. Adicionalmente, se ha observado un efecto tóxico de la triptamina sobre P. putida U. Por último, se ha clonado el promotor del gen hinA, codificante de una permeasa de histamina y cuya expresión se ve inducida por esta amina, en un plásmido dirigiendo la transcripción de genes codificantes de un sistema de bioluminiscencia. Esto ha permitido la obtención de un biosensor capaz de detectar concentraciones variables de histamina.[EN] Biogenic amines are of great relevance in food safety due to their involvement in numerous food poisonings. Every year, thousands of people worldwide suffer from the adverse effects of ingestion of spoiled food, which generates important public health problems. In particular, histamine and tyramine have been identified as the main biogenic amines responsible for adverse reactions, including hypertensive crises and severe gastrointestinal symptoms. The presence of elevated levels of amines in fermented products, fish and processed meats has led to the implementation of stricter regulations in the food industry. Biogenic amines are nitrogenous compounds derived from the decarboxylation of amino acids that occur naturally in living organisms and play essential roles in them. These compounds have a direct impact on human metabolism, as they can act as neurotransmitters, immune system modulators or precursors of other biomolecules. However, when they accumulate in high concentrations in food, they can trigger toxic effects in consumers, especially in people with deficiencies in the enzymes responsible for their degradation. The presence of biogenic amines in food is a widely documented phenomenon. They are mainly found in fermented products, such as cheese, sausages, wine and beer, due to the microbial activity that transforms the amino acids present in the raw material. They are also detected in poorly preserved fish and seafood, where the proliferation of bacteria causes a significant increase in their levels. The regulation of their concentration in these products is an important challenge for the food industry, which must apply strict quality controls to avoid risks of intoxication. Over the years, several studies have addressed the catabolism of biogenic amines in different organisms. In humans and animals, amino oxidases play a crucial role in their degradation. At the microbial level, multiple bacterial species have been shown to be able to metabolize biogenic amines, which has aroused great interest in their potential biotechnological application. Among these species, Pseudomonas putida U stands out for its metabolic versatility and its ability to use different chemical compounds as a source of carbon and energy, which makes it an excellent study model to better understand the mechanisms of catabolism of these substances and to explore its potential in the elimination of toxic compounds in food. Using advanced genomic sequencing techniques, we have obtained the complete genome sequence of P. putida U. This has allowed us to locate within it the Tn5 insertion points of all the mutants previously obtained by our research group. Likewise, using this same transposon, different mutants affected in the metabolism of different compounds have been isolated. Mutants affected in propionate catabolism (prpC and PPU_10225) have revealed the role they play in the degradation of aliphatic monoamines and fatty acids with an odd number of carbons. The Tn5 transposon insertion in dadA and dadR gene, genes involved in alanine metabolism, are essential for P. putida U to grow using cadaverine as the sole carbon and energy source, while HinI, an aspartate aminotransferase, is involved in the catabolism of Delta-aminovaleric acid. The gltA gene, which encodes citrate synthase in Pseudomonas has also been shown to play an important role in the catabolism of aliphatic and aromatic monoamines, as well as fatty acids between 3 and 5 carbon atoms, phenylacetic acid and Delta-aminovaleric acid. Finally, mutagenesis using the Tn5 transposon has allowed the identification of genes involved in polyamine transport and metabolism in P. putida U. Studies of the transcriptome of P. putida U using putrescine or cadaverine as the sole source of carbon and energy have identified 1770 and 2292 differentially expressed genes. Likewise, the expression of the presumed genes involved in the deamination of putrescine and cadaverine has been studied, finding that spuC1 is overexpressed in the presence of both amines and revealing the existence of a second gene spuC2 whose expression is increased only by the addition of cadaverine to the medium, but not by putrescine or the metabolic intermediates of these polyamines. Regarding the catabolism of Gamma-aminobutyric and Delta-aminovaleric acids, it has been shown that of the 3 putative genes involved in their deamination (gabT1-T3) only gabT1 is overexpressed in the presence of these acids or their precursor amines (putrescine and cadaverine, respectively). Tryptamine is a biogenic amine whose catabolism by microorganisms has not yet been studied. P. putida U is unable to utilize the amino acid tryptophan or tryptamine (an amine derived from tryptophan) to sustain its growth. However, the addition of another carbon source allows the TynBA system, involved in tyramine deamination, to generate indole-3-acetic acid. This compound has been tested on Cucumis sativus and Nicotiana tabacum, and root induction has been observed. Additionally, a toxic effect of tryptamine on P. putida U. has been observed. Finally, the promoter of the hinA gene, encoding a histamine permease whose expression is induced by this amine, has been cloned in a plasmid directing the transcription of genes encoding a bioluminescence system. This has made it possible to obtain a biosensor capable of detecting variable histamine concentrations.Luengo Rodríguez, José MaríaRodríguez Olivera, ElíasBioquimica y Biologia MolecularFacultad de Ciencias Biologicas y Ambientales2025info:eu-repo/semantics/doctoralThesishttps://hdl.handle.net/10612/25585reponame:BULERIA. 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