Desarrollo y aplicación de métodos quimiométricos multidimensionales al estudio de sistemas enzimáticos
El objetivo de la tesis doctoral es la aplicación de metodologías quimiométricas multidimensionales al análisis de reacciones enzimáticas. Las reacciones enzimáticas estudiadas tienen aplicación en los campos del análisis químico en matrices biológicas y en los procesos de fermentación a escala indu...
| Autor: | |
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| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2007 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | español |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:38113 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/38113 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Enzims Química analítica |
| Sumario: | El objetivo de la tesis doctoral es la aplicación de metodologías quimiométricas multidimensionales al análisis de reacciones enzimáticas. Las reacciones enzimáticas estudiadas tienen aplicación en los campos del análisis químico en matrices biológicas y en los procesos de fermentación a escala industrial. En concreto: 1) Estudio del mecanismo de reacción en matrices biológicas y cálculo de las constantes enzimáticas en reacciones complejas. Se estudia la catálisis de mezclas de hipoxantina, xantina y ácido úrico con xantina oxidasa; en un medio controlado y en orina humana. Además, se determina cuantitativamente los analitos anteriormente mencionados en orina humana. Los perfiles cinéticos se registraron usando un espectrofotómetro Ultravioleta-Visible equipado con un detector de diodos. A este espectrofotómetro se acopló un sistema de flujo interrumpido stopped-flow. Para mantener la temperatura constante se usó un módulo «Peltier». 2) Establecimiento de una metodología para el control en tiempo real de bioprocesos. El sistema estudiado es la producción de enzimas lipasas por el microorganismo Pichia pastoris. Las medidas de fluorescencia se realizaron con un sensor de fluorescencia multidimensional conectado al bioreactor a través de una ventana de cuarzo. 3) Un objetivo no relacionado con la monitorización de reacciones enzimáticas, es el desarrollo de una práctica de laboratorio dirigida a estudiantes de cursos superiores de la licenciatura de Ciencias Químicas para la introducción a los métodos de resolución de curvas y a la quimiometría en general. Se han obtenido las siguientes conclusiones generales: 1) La introducción de la restricción del modelo cinético del sistema estudiado en el algoritmo MCR-ALS ha dado lugar a una nueva metodología de trabajo, denominada HS-MCR-ALS. Su aplicación al sistema cinético enzimático ha hecho posible: · El estudio del sistema enzimático en presencia de interferentes espectrales. · La elucidación del modelo cinético, ya que el anteriormente descrito en la bibliografía no contemplaba la degradación del ácido úrico. · La determinación de las constantes cinéticas del modelo postulado, tanto en un medio tamponado de composición conocida como en orina. 2) Se han aplicado y comparado diferentes métodos, bi o tridimensionales, de análisis multivariable cuantitativo para la determinación de xantina, hipoxantina y ácido úrico en mezclas sintéticas y en orina humana dopada. Los resultados obtenidos en la aplicación cuantitativa del HS-MCR-ALS son comparables a los resultados obtenidos mediante otros algoritmos tridimensionales, 3W-PLS1 y 3W-PLS2, y a los algoritmos bidimensionales clásicos, PLS1 y PLS2, con una mínima cantidad de muestras patrón. 3) Se ha establecido una nueva metodología de trabajo para el control en tiempo real de procesos monitorizados por fluorescencia. Se basa en el seguimiento no invasivo de la reacción mediante una sonda de fluorescencia multidimensional y en el tratamiento de la señal registrada mediante el algoritmo PARAFAC. A partir del modelo PARAFAC, aplicado a bioprocesos desarrollados en condiciones normales, se obtiene una estimación de los perfiles espectrales de los fluoróforos y de la evolución de su señal. El análisis de residuales de este modelo permite establecer límites de control (criterio Q). A partir de esa información, se monitorizó y controló en tiempo real un nuevo lote del bioproceso, siendo posible determinar el punto final de la producción de lipasas y metabolización total de sustrato sin necesidad de medidas off-line de los analitos de interés. 4) Se ha estudiado la evolución espectrofotométrica del ácido 8-hidroxiquinolina-5-sulfónico con el pH como una práctica de laboratorio para la introducción del algoritmo MCR-ALS a estudiantes de cursos superiores de la licenciatura de Químicas. Esta práctica contiene instrucciones de cómo utilizar los datos obtenidos en la valoración para poder aplicar MCR-ALS de una manera sencilla y didáctica. |
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