Molecular characterization of the Ppz1 phosphatase and its regulatory subunit Hal3

La proteína Ser / Thr fosfatasa Ppz1 de S. cerevisiae es un componente importante en el mantenimiento de la homeostasis de cationes monovalentes (K+ y Na+) y, como tal, incide en múltiples procesos celulares, tales como la progresión del ciclo celular y el mantenimiento de la integridad celular. La...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Molero Merinero, Cristina
Tipo de recurso: tesis doctoral
Fecha de publicación:2017
País:España
Institución:Universitat Autònoma de Barcelona
Repositorio:Dipòsit Digital de Documents de la UAB
Idioma:inglés
OAI Identifier:oai:ddd.uab.cat:186977
Acceso en línea:https://ddd.uab.cat/record/186977
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Llevats
Enzims
Descripción
Sumario:La proteína Ser / Thr fosfatasa Ppz1 de S. cerevisiae es un componente importante en el mantenimiento de la homeostasis de cationes monovalentes (K+ y Na+) y, como tal, incide en múltiples procesos celulares, tales como la progresión del ciclo celular y el mantenimiento de la integridad celular. La homeostasis de cationes es un factor clave para la supervivencia de cualquier célula, particularmente para los microorganismos que, como las levaduras, deben hacer frente a los cambios ambientales. Aunque Ppz1 es un enzima relacionado con la ubicua fosfatasa tipo 1 (PP1c), las enzimas tipo Ppz sólo se encuentran en hongos, incluyendo patógenos. Se han identificado dos subunidades reguladoras de S. cerevisiae Ppz1, Hal3 y Vhs3, que se unen a la mitad C-terminal catalítica de Ppz1 e inhiben fuertemente su actividad fosfatasa. La modulación de PP1c por sus muchas subunidades reguladoras ha sido ampliamente caracterizada, interesantemente, Hal3 no parece estructuralmente similar a los inhibidores de PP1c conocidos, con la excepción de la presencia de una secuencia relacionada con RVxF, que se encuentra en la mayoría de los reguladores de PP1c. Este motivo interactúa con un surco hidrofóbico de la fosfatasa, cuya estructura también se conserva en Ppz1. Sin embargo, Hal3 no se une o inhibe in vitro la PP1c de levadura y este motivo parece no ser relevante para su interacción con Ppz1. Por lo tanto, Hal3 parece ser bastante específico hacia Ppz1, lo que sugiere que el mecanismo de regulación de Ppz1 por Hal3 podría diferir de los encontrados para PP1c subunidades reguladoras. Un objetivo principal de este trabajo fue obtener una visión de los mecanismos específicos de regulación de Ppz1 por Hal3. Con este fin, dos enfoques experimentales se llevaron a cabo. En primer lugar, se diseñó un cribado genético para identificar las mutaciones de Ppz1 que liberarían Ppz1 de la regulación de Hal3. Se generó una biblioteca de las versiones de Ppz1 que portaban mutación aleatoria en su dominio catalítico C-terminal y se llevó a cabo un cribado funcional en el fondo slt2. Este cribado produjo 36 variantes, de las cuales 9 llevaron simple y 4 doble cambios de aminoácidos. La caracterización in vivo e in vitro de estas variantes demostró que todas ellas afectaron la capacidad inhibitoria de ser inhibida por, pero no para interactuar con Hal3. La asignación de los residuos mutados en un modelo de Ppz1 localizó estos residuos en una región equivalente a la reconocida en PP1c por el Inhibitor-2. Segundamente, desarrollamos estrategias exitosas para coexpresar en E. coli y purificar el complejo de proteínas formado por Ppz1 (mitad C-terminal) y Hal3. Estas preparaciones permitieron la generación de diversos cristales. Sin embargo, a pesar de los muchos esfuerzos para mejorar los cristales obtenidos, no fueron de suficiente calidad para obtener conjuntos de datos de alta resolución como para resolver la estructura tridimensional del complejo. Hace años se demostró que Hal3 es una proteína multifuncional, porque además de su papel en la regulación de Ppz1, Hal3 contribuye (junto con Cab3 y Vhs3) a la generación de un enzima PPCDC heterotrimérico atípico. Este enzima esencial y conservado existe como una flavoproteína homotrimérica en la mayoría de las especies eucarióticas, y requiere en el centro activo la presencia de residuos His y Cys específicos, así como un Asn conservado. La búsqueda de genomas fúngicos para la presencia de enzimas putativo PPCDC reveló que Schizosaccharomyces pombe contiene un único ORF (SPAC15E1.04, llamado aquí SpHal3)) que podría codificar un Hal3 homólogo. Demostramos que este gen tiene una estructura inusual, siendo el resultado de un evento de fusión génica, que contiene un segmento de tipo Hal3 necesario para la actividad PPCDC (similar a ScHal3) en la región N-terminal y la secuencia que codifica la enzima timidilato sintasa en el extremo C-terminal. Nuestros resultados mostraron que SPAC15E1.04 se expresa como un único polipéptido y que la mitad N-terminal de SpHal3 es suficiente para determinar la actividad de PPCDC, si la mitad C-terminal es capaz de proporcionar la función TS en S. cerevisiae.

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