Structural and functional characterization of the SUMO proteases SENP6 and SENP7

Intercambiar la especifidad de las isoformas de SUMO1 y SUMO2/3 para SENP6/SENP7 SENP6 y SENP7 son los miembros más divergentes de la familia de proteasas SENP y los únicos miembros que llevan cuatro inserciónes o "loops" localizadas en su dominio catalítico. Al sobreponer el dominio catal...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Alegre, Kamela Olivya
Tipo de recurso: tesis doctoral
Fecha de publicación:2013
País:España
Institución:Universitat Autònoma de Barcelona
Repositorio:Dipòsit Digital de Documents de la UAB
Idioma:inglés
OAI Identifier:oai:ddd.uab.cat:113984
Acceso en línea:https://ddd.uab.cat/record/113984
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Ubiquitina
Enzims proteolítics
Descripción
Sumario:Intercambiar la especifidad de las isoformas de SUMO1 y SUMO2/3 para SENP6/SENP7 SENP6 y SENP7 son los miembros más divergentes de la familia de proteasas SENP y los únicos miembros que llevan cuatro inserciónes o "loops" localizadas en su dominio catalítico. Al sobreponer el dominio catalítico de SENP7 sobre el complejo SENP2-SUMO podemos ver una posible interfaz entre el Loop1 de SENP7 y SUMO. También identificamos diferentes residuos de SUMO1 y SUMO2 que podrían formar parte de la interfaz. Diseñamos una serie de mutantes de SUMO1 y SUMO2 donde se intercambian entre ellos los residuos que forman parte de la interfaz. De esta manera fuimos capaces de intercambiar la actividad proteolítica de SENP6 y SENP7 hacia estos substratos. El Loop1 de SENP6 y SENP7 es responsable de la especificidad de la interfaz entre los SUMOs y las SENP6/7 Diseñamos una serie de mutantes del Loop1 de SENP7 dentro de la posible interfaz entre el Loop1 de SENP7 y SUMO para determinar los papeles estructurales y funcionales de los residuos que están dentro de esta región. Los mutantes de SENP6/7 sin el Loop1 perdían gran parte de su actividad, esta se podía recuperar un poco al reemplazar las cuatro prolinas del Loop1 por glicinas. De esta manera probamos que el Loop1 tiene un papel por lo menos estructural en el reconocimiento de SUMO. También identificamos el residuo Lys691 del Loop1 de SENP7 como elemento indispensable en la actividad de la enzima ya que al mutar este residuo por un aspártico disminuye la actividad para sustratos con SUMO2. Por otra parte el residuo Asp71 de SUMO2 es uno de los residuos propuestos para el reconocimiento de SUMO2/3. Cuando mutamos este residuo a lisina, vemos una bajada en la actividad de SENP7. Este hecho sugiere que Asp71 de SUMO2 está interaccionando con Loop1 y quizas con la Lys691, y que la bajada en la actividad es causada por una repulsión de cargas. Por otro lado con el objectivo de estudiar el efecto de Loop1 en la desconjugación de especies SUMOyladas, insertamos los ocho residuos de SENP6 Loop en el dominio catalítico de SENP2. Esta inserción provoca un aumento de la actividad sustancial de SENP2 contra diSUMO en comparación con la forma wild type. Complejos con substratos Para ver si SENP6 es capaz de formar algún complejo estable, producimos cantidades en miligramos de los mutantes inactivos de Δ3SENP6C1030S y de Δ2Δ3SENP6C1030S. Incubamos cada proteasa con los precursors de SUMO, con RanGAP1-SUMO2 y con diSUMO2. De todos los substratos que probamos, diSUMO2 fue el único que podía formar un complejo estable con Δ3SENP6CS y Δ2Δ3SENP6CS por copurificación en una columna de gel fitración. Con Δ2SENP6CS no pudimos formar ningún complejo. Con esta información llegamos a la conclusión que el Loop3 de SENP6 reduce, quizá por razones de entropía, la capacidad de SENP6 de formar un complejo estable con diSUMO2. Caracterización del Loop3 de SENP6 Para descifrar el papel que este loop tiene en el contexto de la proteasa, producimos y purificamos los 185 residuos de Loop3 de SENP6. Análysis 1-H 1-D RMN mostraba una falta de estructura terciaria dentro del loop, pero proteólisis limitada y espectroscopia de masas mostraban un fragmento estable de cerca de 11kDa. Dicroísmo circular y FTIR tambien sugieren la presencia de algunos elementos de estructura secundaria. Globalmente, la caracterización biofísica del Loop3 de SENP6 muestra que el loop es una proteína desestructurada.

Similares en LA Referencia