Expansión "ex vivo" de progenitores hemopoyéticos de sangre de cordón umbilical para trasplante
Introducción: La sangre de cordón umbilical (SCU) contiene una elevada cantidad de progenitores hemopoyéticos (PH) circulantes con capacidad de repoblación medular a largo plazo. Como consecuencia, dicho tejido se ha convertido en alternativa para trasplante. El volumen limitado condiciona que el nú...
| Autor: | |
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| Tipo de documento: | tese |
| Data de publicação: | 2002 |
| País: | España |
| Recursos: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositório: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | espanhol |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:37614 |
| Acesso em linha: | https://ddd.uab.cat/record/37614 |
| Access Level: | Acceso aberto |
| Palavra-chave: | Sang fetal Trasplantació d'òrgans, teixits, etc. |
| Resumo: | Introducción: La sangre de cordón umbilical (SCU) contiene una elevada cantidad de progenitores hemopoyéticos (PH) circulantes con capacidad de repoblación medular a largo plazo. Como consecuencia, dicho tejido se ha convertido en alternativa para trasplante. El volumen limitado condiciona que el número absoluto de células madre sea bajo, repercutiendo en la probabilidad de injerto, fundamentalmente a corto plazo. La evaluación de las experiencias clínicas iniciales han permitido demostrar la correlación entre dosis de PH comprometidos infundidos y velocidad de injerto mieloide. Además, la rápida recuperación de granulocitos y plaquetas disminuye la morbimortalidad relacionada con el procedimiento. La hemopoyesis puede mantenerse in vitro aplicando unas condiciones de cultivo específicas. Mediante la utilización de citoquinas selectivas se pueden generar células in vitro con características funcionales definidas, en unos cultivos llamados de expansión. Hipótesis: La coinfusión de PH obtenidos mediante expansión reducirá el tiempo de neutropenia tras trasplante de SCU. Objetivos: La evaluación de la eficacia, aplicabilidad y resultados de un método de generación de PH mediante expansión. Para ello se han desarrollado los siguientes objetivos específicos, que han sido publicados: - definición de las condiciones de cultivo de expansión que permitan generar PH diferenciados (Haematologica 1999; 84: 493-98). - adaptación de las condiciones básicas de expansión a los requerimientos de los protocolos clínicos: utilización de medios libres de suero y proteínas de origen animal (Haematologica 1999; 84: 675-82). - desarrollo de un protocolo tecnológico de expansión de células CD34+ seleccionadas de SCU y su aplicación clínica (Transfusion 2000; 40: 625-31). Resultados: 1) Papel de la selección celular en el cultivo: A concentración de 105 células/ml la amplificación de PH es significativamente mayor partiendo de células seleccionadas que de células mononucleadas (16 veces mayor). 2) Generación de células según combinación de citoquinas: la adición de citoquinas de acción temprana, de acción intermedia y/o tardía promueve una mayor generación de PH comprometidos, así la presencia de SCF y G-CSF es necesaria para amplificar 4 veces el nº de células nucleadas en 6 días. 3) Presencia continuada de citoquinas: En cultivos de 6 días, existe un mayor rendimiento proliferativo (hasta 2 veces más) si se adicionan citoquinas diariamente, y/o se utilizan formas glicosiladas que aumentan su vida media. 4) Cultivo libre de suero: Es posible substituir la función del suero de ternera fetal utilizando medios libres de suero comerciales y citoquinas de amplio espectro: SCF, IL6 e IL3. Se consiguen tasas de expansión equivalentes y se disminuye el coeficiente de variación (107% frente 61%). 5) Papel de FLT3-L y TPO en la expansión: Para generar de forma continua PH comprometidos es necesario mantener funcionales las células madre hemopoyéticas. Mediante el análisis de las células formadoras de área en empedrado (CAFC) de 5 semanas, se ha podido de terminar que la combinación más beneficiosa incluye SCF, FLT3-L, IL6, IL3 y MIP-1a (recuperación del 95% de CAFC a los 6 días de cultivo). La substitución de IL3 y MIP por TPO mejora los resultados y permite recuperar hasta un 145% de CAFC. 6) Método de selección positiva tras descongelación de SCU: Se ha adaptado un método de uso clínico (Isolex-300i de Baxter) para pequeñas muestras de SCU criopreservadas. Se realiza sensibilización previa de las bolas magnéticas con el monoclonal anti-CD34 (9C5) y se adiciona un tampón con DNAasa recombinante humana. La pureza media es del 69% y la recuperación del 52%. 7) Selección y expansión en bolsas semipermeables para uso clínico: Se realiza la selección celular con el método inmunomagnético directo descrito y se traspasan las células obtenidas a bolsas semipermeables de Teflon para expansión. Tras 6 días de cultivo en medio libre de suero en presencia de SCF, FLT3-L, IL6 y TPO, las células CD34+ iniciales se incrementan 7 veces. 8) Estudio piloto: doble trasplante de SCU (una unidad expandida, otra no manipulada). Este método se utilizó en 5 procedimientos clínicos. Se incrementó el nº de PH en un 100% aproximadamente (0,23x106 CD34 expandidas /kg). Sólo se detectó quimera molecular de la unidad expandida los primeros 14 días. La recuperación de neutrófilos se produjo en los días 17-27 a partir de la unidad no manipulada. Discusión: El método descrito permite la generación de PH comprometidos. Durante 6 días de cultivo se amplifica 1 logaritmo el contenido inicial. Este aumento no tiene relevancia clínica. Experiencias de otros autores han mostrado que las células expandidas son capaces de generar neutrófilos en sangre periférica cuando se infunden alrededor de 40x106 CN/kg. Esto supone incrementar hasta 3 logaritmos la expansión, y sólo puede conseguirse incrementando el tiempo de cultivo con el método propuesto. Para ello, se debe establecer un protocolo de al menos 14 días de expansión. Conclusiones: El método biotecnológico descrito, constituye una plataforma terapéutica que permite su desarrollo y adaptación a diferentes objetivos clínico-biológicos basados en la expansión ex vivo de PH. |
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