Producció de proteïnes recombinants mitjançant la tecnologia Zera® en diferents sistemes eucariotes: desenvolupament d’estratègies de processament.
[cat] ERA Biotech S.A. és una empresa que desenvolupa la seva pròpia tecnologia per a la producció de proteïnes i pèptids d’alt valor afegit. El mètode de producció i acumulació de proteïna recombinant es basa en el mecanisme natural d’acumulació de proteïnes de reserva de blat de moro (zeïnes) en o...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2012 |
| País: | España |
| Institución: | Universidad de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de la UB |
| OAI Identifier: | oai:diposit.ub.edu:2445/36309 |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/2445/36309 http://hdl.handle.net/10803/77950 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Proteïnes recombinants Cèl·lules eucariotes ADN recombinant Recombinant proteins Eukaryotic cells Recombinant DNA |
| Sumario: | [cat] ERA Biotech S.A. és una empresa que desenvolupa la seva pròpia tecnologia per a la producció de proteïnes i pèptids d’alt valor afegit. El mètode de producció i acumulació de proteïna recombinant es basa en el mecanisme natural d’acumulació de proteïnes de reserva de blat de moro (zeïnes) en orgànuls densos derivats de reticle endoplasmàtic anomenats cossos proteics. La tecnologia Zera® empra el domini ric en prolina de l’extrem N-terminal de la γ-zeïna per induir la formació de novo de cossos proteics heteròlegs en teixits i cèl•lules eucariotes. L’elevada densitat que presenten aquests orgànuls permet una recuperació i enriquiment de la proteïna de fusió d’interès, mitjançant tècniques d’homogeneïtzació i fraccionament cel•lular. Originàriament dissenyats per permetre la purificació per afinitat del proteïna d’interès, els elements de fusió també poden ajudar a mantenir l’estabilitat, el plegament i la solubilitat del producte. Malgrat tot, per a algunes aplicacions posteriors es requereix la producció de la proteïna nativa, amb el qual són necessàries etapes de proteòlisi mitjançant endoproteases específiques. En un context industrial l’addició d’una proteasa exògena suposa l’etapa més costosa en el procés de producció. A més, les condicions de processament poden arribar a interferir amb l’activitat biològica del component purificat. Un dels objectius principals de moltes empreses dedicades a la producció de proteïnes recombinants, tracta de cercar alternatives al processament convencional per addició de proteases exògenes. L’objectiu general d’aquest treball s’ha centrat en el desenvolupament i aplicació de dues estratègies de processament aplicades a proteïnes recombinants de fusió produïdes mitjançant la tecnologia Zera®, en diferents sistemes d’expressió. La primera aproximació ha consistit en la producció d’enteroquinasa bovina (EK), endoproteasa específica, mitjançant la tecnologia Zera®. La producció d’enteroquinasa pròpia evitaria l’adquisició comercial de la mateixa, amb el qual es reduirien els costos globals de producció. S’han dissenyat diferents construccions amb el domini catalític de l’enteroquinasa fusionat al domini Zera® per tal de permetre la seva acumulació en cossos proteics heteròlegs. Degut a la conformació catalítica que adopta, observàrem que el seu extrem N-terminal havia de romandre lliure per tal de mantenir la seva activitat proteolítica. La fusió del domini Zera® al extrem C-terminal d’EK va resultar incompatible amb la viabilitat de les cèl•lules de mamífer o del teixit foliar de tabac, indicant cert grau de citotoxicitat promogut per la proteasa activa. D’altra banda, el bloqueig de l’extrem N-terminal d’EK mitjançant la fusió del domini Zera®, requeria d’una etapa prèvia de processament per tal d’activar la proteasa in vitro. Els baixos nivells d’expressió assolits en cèl•lules de mamífer, juntament amb la baixa idoneïtat de l’estratègia, varen motivar l’exploració d’altres alternatives de processament. La segona aproximació descrita en aquest treball es basa en l’estudi de l’autoprocessament de proteïnes de fusió mitjançant inteïnes. Les inteïnes són elements proteics naturals capaços de promoure l’splicing de proteïnes a través d’una sèrie de reaccions que permeten la seva auto-excissió i la unió dels fragments que les flanquegen o exteïnes. Certes modificacions genètiques en residus clau de la seqüència de les inteïnes, han permès modular la seva activitat per permetre l’autoprocessament in vitro de forma controlable. S’ha estudiat l’aplicació de dos tipus diferents d’inteïnes induïbles per al processament de proteïnes de fusió Zera®, en cèl•lules de mamífer, en cèl•lules d’insecte, i en planta de tabac. El rendiment global del procés de producció de rhGH (com a proteïna model), fou analitzat i comparat emprant dos sistemes de processament diferents sobre la proteïna de fusió Zera® expressada en planta de tabac: el mediat per la inteïna MxeGyrA, i el de la proteasa comercial enteroquinasa. Tot i que els costos globals de producció de rhGH resultaren similars per ambdós processos, el rendiment de producció fou notòriament major en el procés emprant la inteïna. L’èxit de l’aplicació de les inteïnes a la tecnologia Zera®, ha comportat un avenç en el procés de downstream, facilitant de manera significativa la recuperació de la proteïna nativa d’interès. |
|---|