Influència estructural i funcional de mutacions extrecel·lulars de la bacteriorodopsina: efectes locals i a llarga distància
La bacteriorodopsina (bR) és una proteïna transmembranal de set hèlices a de l'arqueobactèria Halobacterium salinarum. La bR té unida covalentment via una Base de Schiff (BS) protonada una molècula de retinal, cromòfor responsable de que, activada per la llum, la bacteriorodopsina bombegi proto...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2003 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/3506 |
| Acceso en línea: | http://www.tdx.cat/TDX-0621104-184251 http://hdl.handle.net/10803/3506 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Membrana púrpura Halobacterium salinarum Bacteriorodopsina Ciències Experimentals 577 |
| Sumario: | La bacteriorodopsina (bR) és una proteïna transmembranal de set hèlices a de l'arqueobactèria Halobacterium salinarum. La bR té unida covalentment via una Base de Schiff (BS) protonada una molècula de retinal, cromòfor responsable de que, activada per la llum, la bacteriorodopsina bombegi protons des de l'interior al exterior de la cèl·lula. Aquest bombeig es realitza mitjançant un fotocicle, successió d'estats conformacionals i bioquímics anomenats intermediaris pels que passa la proteïna per dur a terme la translocació de protons. El gradient electroquímic de protons generat es aprofitat per les ATP sintases per a sintetitzar ATP, energia que és utilitzada per la bactèria en cas d'emergència quan hi ha una baixa disponibilitat d'oxigen en l'ambient. Gràcies al interès que despertà el descobriment d'un sistema fotosintètic tan senzill, la bR és una de les proteïnes transmembranals més conegudes i s'usa com a model per a l'estudi d'altres proteïnes de membrana com són els receptors acoblats a proteïna G. <br/>El treball presentat en aquesta tesi es troba centrat en la regió extracel·lular de la proteïna i s'ha agrupat en tres blocs diferents. En el primer, s'ha estudiat el rol funcional i estructural de diversos grups formadors de ponts d'hidrogen mitjançant les mutacions R7E/E9R, Y79F i S193A. L'estudi d'aquests mutants mostra que la tirosina 79, l'arginina 7 i el glutàmic 9 són grups importants per el manteniment estructural de la bR, ja que aquestes mutacions produeixen una acceleració en el temps de reacció de la hidroxilamina, indicant una menor compactació de les hèlices en aquests mutants. Aquestes alteracions de la bR produeixen alhora una disminució en l'estabilitat tèrmica de la proteïna. No obstant, aquestes mutacions no afecten de manera rellevant la funció de la bR, excepte pel fet de disminuir en una unitat de pH el pKa del complex alliberador del protó. La Tyr 79, el Glu 9 i l'Arg 7 es troben actuant com a nexe d'unió entre una xarxa d'aigües principal que connecta el retinal amb la zona extracel·lular de la proteïna, i una xarxa d'aigües local. Per una altra banda, la substitució de la serina 193 per una alanina dóna lloc a canvis estructurals de la proteïna i a un augment en el pKa del complex alliberador del protó, apart d'una important disminució en l'eficiència bombejadora de protons, demostrant que aquesta serina, mitjançant les seves interaccions amb el glutàmic 204, s'encarrega de mantenir la correcta funcionalitat i estructura del complex.<br/>En el segon bloc s'ha estudiat el paper funcional y estructural de les prolines 8, 77 i 200 que, disposades en forma de butxaca, es troben albergant quatre molècules d'aigua que formarien una xarxa d'aigües local. Encara que les prolines actuarien podrien interaccionar mitjançant un pont d'hidrogen amb aquestes molècules d'aigua, sembla ser que la distància entre els diferents grups seria massa important com per que dita interacció succeís. No obstant, la rigidesa de la cadena polipeptídica generada per les prolines, donaria lloc a que grups veïns a aquestes prolines poguessin interaccionar amb la xarxa d'aigües. La substitució d'aquestes prolines per glicines de forma individual i triple, i la substitució de la prolina 8 per un triptòfan, donen lloc a una sèrie d'alteracions importants en l'entorn del retinal, com és un increment en el pKa del principal contraió de la BS, l'Asp 85, o la disminució del pKa de la BS. Aquestes alteracions van acompanyades d'una menor compactació de les hèlices en realitzar les mutacions tal i com indiquen els experiments d'accessibilitat per la hidroxilamina. En el cas del mutant P200G el que s'ha observat ha estat una més gran compactació de la proteïna comparant amb la bR silvestre, indicant que al substituir la prolina per una glicina s'està donant una més gran rigidesa en les hèlices durant el fotocicle. Les mutacions P8W, P77G i P200G, a més a més presenten una important disminució en la capacitat bombejadora de protons. Tots aquests efectes es produirien per una alteració en les interaccions entre els grups veïns a les prolines i les molècules d'aigua de la xarxa local i altres grups de la proteïna. En el tercer i darrer bloc presentat, s'han aportat dades vers la relació a llarga distància entre l'aspàrtic 96 i el glutàmic 194. L'Asp 96 es troba localitzat en la regió citoplasmàtica de la bR, i és el grup encarregat de reprotonar la BS un cop aquesta s'ha desprotonat. Quan aquest aspàrtic és substituït per una asparragina, el protó que ha de reprotonar la BS prové directament del citoplasma, fet que fa més lenta la seva reprotonació. El Glu 194 per altra banda es troba localitzat en la regió extracel·lular i forma part del complex alliberador del protó. Quan s'afegeix la mutació E194Q al mutant D96N s'observa una important acceleració en la reprotonació de la BS tal i om ho indiquen els experiments de fotòlisi de llampec i espectroscòpia d'infraroig. Aquests resultats indicarien que l'anul·lació de la càrrega negativa del glutàmic 194 situat a la regió extracel·lular, estaria afectant l'entrada de protons des del costat citoplasmàtic indicant doncs, una interacció a llarga distància. El doble mutant a més presenta una important alteració del mecanisme de bombeig de protons, no solament perquè l'expulsió i recaptació del protó es realitza simultàniament en la proteïna, sinó perquè també l'eficiència del bombeig en aquest mutant és d'un 35 % comparat amb la bR silvestre.<br/>En aquest treball a més s'ha demostrat que com que l'aparició de l'intermediari M depèn de l'estat de protonació del Glu 194, el pKa d'aparició d'aquest intermediari és en realitat el pKa del complex alliberador del protó en l'estat basal de la proteïna. Per altre costat, els resultats de pKa alcalí obtingut per als diferents mutants estudiats en aquesta tesi, mostren que la desprotonació de la BS no és suficient per produir la desnaturalització de la proteïna degut a pH alcalí, sinó que a més seria necessària la desprotonació d'altres grups a pH bàsics com podrien ser diverses tirosines. |
|---|