Estudis bioquímics i estructurals de diferents formes de nucleoplasmina. Interacció amb histones i altres proteïnes bàsiques.
La nucleoplasmina (NP) és la proteïna majoritària del nucli dels oòcits i ous no fecundats de la granota "Xenopus laevis" i altres amfibis. Es tracta d'una proteïna acídica amb tres trams acídics principals (A1, A2, A3). La NP participa en la remodelació de la cromatina durant la fecu...
| Autor: | |
|---|---|
| Formato: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2003 |
| País: | España |
| Recursos: | Universitat Politècnica de Catalunya (UPC) |
| Repositorio: | UPCommons. Portal del coneixement obert de la UPC |
| Idioma: | catalán |
| OAI Identifier: | oai:upcommons.upc.edu:2117/93743 |
| Acesso em linha: | https://hdl.handle.net/2117/93743 https://dx.doi.org/10.5821/dissertation-2117-93743 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palavra-chave: | mutagènesi dirigida proteïna recombinant dicroisme circular "Xenopus laevis" histones cristal·lografia proteïnes espermàtiques bàsiques electroforesi cromatografia nucleoplasmina ultracentrifugació analítica 2302. Bioquímica Bioquímica Proteïnes espermàtiques Àrees temàtiques de la UPC::Enginyeria química |
| Resumo: | La nucleoplasmina (NP) és la proteïna majoritària del nucli dels oòcits i ous no fecundats de la granota "Xenopus laevis" i altres amfibis. Es tracta d'una proteïna acídica amb tres trams acídics principals (A1, A2, A3). La NP participa en la remodelació de la cromatina durant la fecundació, mediatitzant la descondensació de la cromatina espermàtica i facilitant l'acoblament de nucleosomes gràcies a la seva funció de xaperona molecular. <br/>En el decurs d'aquest treball s'ha continuat l'estudi dels diferents recombinants de la NP de què disposem, posant especial èmfasi en la forma mutant r-NP142, que es caracteritza pel fet que té el tram acídic principal A2 molt exposat. Interessava determinar la influència de diferents condicions en l'estabilitat i el grau de pentamerització de la molècula. En aquesta mateixa línia es va estudiar el paper de les Cys de la NP en la pentamerització. Mitjançant mutagènesi dirigida es van substituir les Cys per Ser i es va observar que concretament la mutació de la Cys 45 afavoria la monomerització de la forma r-NP142, però no afectava l'oligomerització de les formes r-NP i r-NP121, les quals romanien pentamèriques. Aquests resultats suggereixen que no hi hauria ponts disofre en l'estructura pentamèrica de la nucleoplasmina. La caracterització estructural de la nucleoplasmina es va intentar abordar a diferents nivells. A nivell de l'estructura secundària, es van utilitzar tècniques de dicroisme circular. Concretament es va determinar que el mutant r-NP142 C45S tenia una estructura plegada a l'atzar (random coil). D'altra banda, per a ordres estructurals superiors es van utilitzar tècniques de microscòpia electrònica i tècniques cristal·logràfiques. <br/>Un altre objectiu d'aquest treball va ser la caracterització de les interaccions de l'NP amb histones del nucli del nucleosoma. Estàvem especialment interessats a veure si la interacció NP-histones era fonamentalment de tipus electrostàtic o bé podria tractar-se d'algun altre tipus d'interacció. Mitjançant ultracentrifugació analítica i gradients de sacarosa es va poder determinar que la NP podia unir els quatre tipus d'histones nucleosòmiques. Aquesta unió tindria una estequiometria corresponent a 1 mol de pentàmer de NP per mol d'octàmer d'histones. Cal destacar que la NP pot unir també histones tripsinitzades (sense les cues bàsiques) mantenint la mateixa estequiometria que per al cas de les histones natives. Així mateix, la forma r-NP121 (sense el tram acídic A2) és capaç d'unir histones natives amb la mateixa estequiometria descrita per als casos anteriors. Aquests experiments indiquen que la interacció NP-histones no seria predominantment electrostàtica. <br/>Un altra línia de treball va ser estudiar la presència o no d'una NP-like a l'extracte d'oòcits de l'estrella de mar "Echinaster sepositus". S'ha trobat una proteïna majoritària que presenta les propietats de ser termoestable, acídica i parcialment resistent al sulfat amònic. Aquesta proteïna és reconeguda pels anticossos policlonals antinucleoplasmina obtinguts en ous de gallina. D'altra banda, no és capaç de descondensar nuclis espermàtics que contenen protamina.<br/>El darrer objectiu del treball va ser l'estudi estructural de la proteïna ?0. La ?0 és específica del nucli espermàtic de l'equinoderm "Holothuria tubulosa" i presenta propietats intermèdies entre les protamines i les histones. La cristal·lització d'una molècula d'aquestes característiques aportaria informació sobre l'estructura de les proteïnes que participen en la compactació de la cromatina i podria obrir un nou camí per a la cristal·lització de les protamines i dels complexos NP-protamina. |
|---|