Characterization of PRRSV1 infection in bone marrow-derived dendritic cells

Esta tesis tiene como objeto caracterizar la adhesión, la replicación y la inducción de apoptosis en células dendríticas inmaduras (i) y maduras (m) derivadas de médula ósea (BMDC) enfrentadas al virus del PRRS (VPRRS). Se utilizaron tres aislados de PRRSV1 (3249, 3262 y 3267) cuya cinética de repli...

Full description

Bibliographic Details
Author: Li, Yanli
Format: doctoral thesis
Publication Date:2017
Country:España
Institution:Universitat Autònoma de Barcelona
Repository:Dipòsit Digital de Documents de la UAB
Language:English
OAI Identifier:oai:ddd.uab.cat:188067
Online Access:https://ddd.uab.cat/record/188067
Access Level:Open access
Keyword:Porcs
Síndrome respiratori i reproductiu porcí
Malalties transmissibles en els animals
Description
Summary:Esta tesis tiene como objeto caracterizar la adhesión, la replicación y la inducción de apoptosis en células dendríticas inmaduras (i) y maduras (m) derivadas de médula ósea (BMDC) enfrentadas al virus del PRRS (VPRRS). Se utilizaron tres aislados de PRRSV1 (3249, 3262 y 3267) cuya cinética de replicación se determinó inicialmente en macrófagos alveolares porcinos (PAM). El título obtenido en iBMDC fue significantemente mayor que en mBMDC (12 y 24hpi). Para los aislados 3249 y 3262, la replicación alcanzó el pico antes en las iBMDC (24h) que en las mBMDC (48h). Además, la eficacia de replicación dependía de la cepa usada siendo la cepa 3262 la que siempre tuvo menor replicación e infectó a una menor proporción de células. El estudio de adhesión y replicación con relación a la expresión de tres receptores: PoSn, CD163 y sulfato de heparán, se estudió mediante microscopía confocal de tres colores (PoSn, CD163 and PRRSV), y reveló que en iBMDC existía adhesión en las 4 subpoblaciones definidas por PoSn y CD163, incluso después del bloqueo del sulfato de heparán. Estos resultados sugerían la posibilidad de que existieran otros receptores víricos. Seguidamente, se realizó un estudio de microscopía confocal con marcaje de CD163/PRRSV o PoSn/PRRSV, observándose replicación en células aparentemente PoSn- y CD163-. A continuación se estudió la expresión de CD163 en las iBMDC infectadas por la cepa 3267 mediante citometría. Es este caso, el 8.4±0.5% de células aparentemente CD163- se marcaron como infectadas. Tras esto, se realizó una separación por citometría de flujo en función de la expresión de CD163 (CD163-, CD163lo and CD163hi). La primera separación se centró en aquellas CD163- cuya clasificación estaba "más allá de la duda". La segunda, se enfocó en el grupo de células CD163- junto con CD163lo. Como controles se emplearon iBMDC sin separar. No se observó infección en las células CD163- "más allá de la duda". Cuando las CD163- se clasificaron junto con células CD163lo, la población CD163- infectada fue de 0,6 ± 0,07% a las 40 hpi aumentando a 1,6% ± 0,08% a las 60 hpi, siendo la proporción de células infectadas mayor que el número inicial de células CD163+. Este hecho podría ser debido a la generación de nuevas células CD163lo que se infectarían tan pronto como expresaran esta molécula, o alternativamente, el medio creado por la infección de células CD163+ indujo la aparición de la población CD163- susceptible. El estudio de inducción de la apoptosis, en PAM se observó un marcaje positivo para la caspasa-3 activada tanto en células infectadas como no infectadas para los tres aislamientos (microscopía confocal). Por el contrario, en BMDC el marcaje se localizó principalmente en células no infectadas. Este hallazgo sugiere la diferente activación de las vías intrínseca y extrínseca para PAMs y BMDC. Además, la señal de caspasa-3 en BMDC alcanzó un máximo a las 48 hpi, más tarde que en PAM (24 hpi). Este desarrollo más lento de la apoptosis podría permitir más ciclos de replicación vírica, resultando en mayores rendimientos víricos en BMDC. Un examen posterior para apoptosis/necrosis de cultivos de BMDC mostró que los aislados 3249 y 3267 indujeron apoptosis y necrosis, mientras que 3262 sólo produjo cambios menores. La neutralización de la IL-10 inducida por el 3262 dio lugar a la aparición de células apoptóticas, pero este efecto no ocurrió con 2988 que inducía también la producción de IL-10. Por lo tanto, todavía no está claro el papel de IL-10 juega en la apoptosis inducida por PRRSV. Los resultados de esta tesis pueden ser útiles para comprender el papel de DC en la patogénesis de PRRSV.

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