Estudio funcional de Ypi1, una subunidad reguladora esencial de la proteína fosfatasa Glc7
La fosfo-desfosforilació de residus serina, treonina y tirosina és un dels mecanismes de regulació de proteïnes més estès en els éssers vius. Aquest tipus de reaccions és dut a terme d'una manera estrictament coordinada per les proteïnes quinases i fosfatases. El genoma del llevat Saccharomyces...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2010 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/402488 |
| Acceso en línea: | http://hdl.handle.net/10803/402488 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Sacharomyces cerevisiae Ciclo celular Cicle cel·lular Cell cycle Checkpoints Ciències Humanes 577 |
| Sumario: | La fosfo-desfosforilació de residus serina, treonina y tirosina és un dels mecanismes de regulació de proteïnes més estès en els éssers vius. Aquest tipus de reaccions és dut a terme d'una manera estrictament coordinada per les proteïnes quinases i fosfatases. El genoma del llevat Saccharomyces cerevisiae codifica un nombre més elevat de Ser/Thr quinases que de fosfatases. Per dur a terme la seva funció biològica, algunes Ser/Thr fosfatases han desenvolupat una estratègia evolutiva basada en la unió a subunitats reguladores, que determinen la seva localització subcel·lular, activitat i/o especificitat de substrat. Una de les Ser/Thr més estudiades en els últims anys és la fosfatasa de tipus 1 (PP1). Aquesta proteïna, molt conservada evolutivament, és essencial i està involucrada en multitud de processos biològics diferents, des del metabolisme de carbohidrats fins a la regulació del cicle cel·lular. Tant l'absència com l'excés d'activitat PP1 són perjudicials per a la cèl·lula, motiu pel qual aquesta proteïna presenta una regulació extremadament fina, presentant una multitud de subunitats reguladores que s'encarreguen de modular la seva activitat. L'estudi de la unió entre diferents subunitats reguladores i la fosfatasa han permès aprofundir en el coneixement de la regulació de la fosfatasa PP1. A més, han permès identificar, entre unes altres, una zona present en moltes d'aquestes subunitats reguladores, denominat motiu *RVxF, que és necessari per a la unió amb la fosfatasa i que interacciona amb una regió hidrofòbica de PP1 situada lluny del centre catalític de l'enzim. El genoma del llevat S. cerevisiae conté únicament un gen, denominat GLC7, que codifica l'única isoforma catalítica de la PP1 en aquest organisme. Al moment d'iniciar aquest treball el nostre grup de recerca en col·laboració amb el laboratori del Dr. Pascual Sanz (IBV, CSIC, València) acabava de caracteritzar al primer inhibidor endogen de la proteïna fosfatasa Glc7, denominant-la Ypi1 (Yeast phosphatase inhibitor-1). Aquest estudi va demostrar que aquesta proteïna interactua físicament amb Glc7 in vivo i és capaç d'inhibir la seva activitat fosfatasa in vitro. La delecció de YPI1 és letal, la qual cosa indica un paper important en la biologia cel·lular. Per això ens plantegem estudiar els efectes fenotípics atribuïbles a un increment de la seva expressió, així com la creació de mutants condicionals (basats tant en l'ús d'un degrón com en sistemes d'expressió del promotor tetO regulable per doxiciclina) amb la finalitat d'elucidar el mecanisme pel qual Ypi1 estaria regulant algunes de les funcions essencials de Glc7. Així, observem que les cèl·lules que sobreexpresan YPI1 exhibeixen un fenotip consistent amb tolerància salina, probablement a través de la regulació de la ATPasa de sodi ENA1. A més, la disponibilitat d'aquests mutants condicionals de ypi1 ha permès demostrar que la funció que aquest regulador exerceix sobre la fosfatasa Glc7 està vinculada amb el manteniment de la integritat de la paret cel·lular. D'altra banda, la falta de Ypi1 resulta en un dramàtic bloqueig en la transició G2/M del cicle cel·lular, amb gemmes anormalment allargades, i spindles mitòtics curts, encara que les bases moleculars d'aquests fenotips no han estat esclarides per complet. Els nostres resultats recents mostren que l'absència de Ypi1 provoca una estabilització de la securina Pds1, suggerint una activació dels checkpoints que regulen la transició G2/M. El bloqueig en G2/M, provocat per la falta de Ypi1 encara persisteix en cèl·lules freturoses de MAD1/MAD2 o RAD9, a pesar que aquestes cèl·lules manquen de components clau en la senyalització dels checkpoints del spindle i de dany en el DNA, respectivament. En contrast, la delecció de SWE1, que codifica una proteïna quinasa necessària per a l'activació del checkpoint de la morfogènesis, permet la sortida del bloqueig en G2/M del mutant ypi1 i recupera la morfologia normal de les cèl·lules, encara que aquestes no són capaces de sobreviure. L'absència de Ypi1 provoca una estabilització de Swe1, que comporta una persistent fosforilació de la proteïna quinasa Cdc28 en la Tyr19, inhibint la seva activitat i bloquejant la progressió del cicle cel·lular. Aquesta seqüència d'esdeveniments són els responsables d'induir una activació del checkpoint de la morfogènesis. A més, hem observat que l'absència de Ypi1 provoca un assemblatge defectuós de l'anell de septines en el coll de la gemma, podent ser aquesta la causa del bloqueig característic en G2/M descrit en aquestes cèl·lules. Finalment, no es descarta la possibilitat que la falta de Ypi1 podria involucrar l'activació de chekpoints addicionals, ja que l'estabilització de la securina Pds1 encara s'observa en cèl·lules tetO7:YPI1 swe1, a pesar que aquestes progressen a través de la mitosi. D'altra banda, la falta de Ypi1 provoca una forta disminució en l'expressió de CDC26, que codifica una subunitat del APC/C. Cèl·lules amb manca de CDC26 sofreixen un bloqueig en G2/M, amb spindles anormalment curts, fenotip idèntic a l'observat en absència de YPI1. La sobreexpresió de CDC26 permet que cèl·lules amb manca de Ypi1 progressin a través de la mitosi, encara que no corregeix el fenotip de letalitat, deixant oberta la possibilitat que Ypi1 podria modular la funció de Glc7 sobre el APC. |
|---|