Regulación de la proteína fosfatasa Ppz1 por su subunidad Hal3: un análisis por mutagénesis
La proteïna fosfatasa Ppz1 de l'organisme model S. cerevisiae es divideix en dues regions diferenciades: un domini N-terminal desestructurat i un domini catalític C-terminal. El domini catalític guarda una alta identitat amb la fosfatasa PP1c. Ppz1 és un dels majors determinants de la homeòstas...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2022 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/687649 |
| Acceso en línea: | http://hdl.handle.net/10803/687649 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Fosfatasa Phosphatase Regulació Regulación Regulation Llevat Levadura Yeast Ciències Experimentals 577 |
| Sumario: | La proteïna fosfatasa Ppz1 de l'organisme model S. cerevisiae es divideix en dues regions diferenciades: un domini N-terminal desestructurat i un domini catalític C-terminal. El domini catalític guarda una alta identitat amb la fosfatasa PP1c. Ppz1 és un dels majors determinants de la homeòstasi salina, regulant negativament els principals canals d'entrada de K+, Trk1 i Trk2, i inhibint la transcripció del gen ENA1, que codifica la ATPasa Ena1, encarregada d'exportar Na+ i K+. A més, Ppz1 està regulada negativament per dues subunitats: ScHal3 i Vhs3, essent ScHal3 la més rellevant in vivo. S. cerevisiae posseeix una tercera proteïna relacionada estructuralment amb ScHal3 i Vhs3, denominada Cab3, que no és un inhibidor de Ppz1. Les proteïnes Hal3 i Vhs3 són proteïnes moonlighting ja que, juntament amb Cab3, formen un heterotrímer que constitueix l'enzim PPCDC, el qual catalitza la tercera reacció de la via de síntesi de coenzim A. Tot i l'elevada identitat entre PP1c i Ppz1, ScHal3 no regula les PP1c. Mitjançant estudis d'entrecreuament químic i anàlisi de seqüències, el nostre laboratori va identificar dos residus distintius entre les fosfatases PP1c i les Ppz (lisines en PP1c que majoritàriament són aminoàcids àcids en Ppz1) que possiblement interaccionen amb ScHal3. El primer objectiu d'aquesta Tesi ha estat comprovar si aquests residus (D566 y D615) són elements claus en Ppz1 per la regulació de la fosfatasa per part de ScHal3. Hem demostrat que el residu D615 és un determinant estructural diferencial entre les PP1c i les Ppz, i que pot contribuir al mecanisme específic de regulació de les fosfatases Ppz per proteïnes tipus Hal3. La PPCDC d'Arabidopsis thaliana és un homotrímer compost per tres subunitats de AtHal3. En el segon capítol d'aquesta Tesi identifiquem dos residus (G115 y L117), ubicats al nucli hidrofòbic de la PPCDC d'A. thaliana que podrien ser rellevants en la formació d'aquest enzim. Per verificar-ho, vam construir versions mutades en aquests residus i els equivalents en ScHal3 (L403 i L405). Després de caracteritzar-les, vam demostrar que aquests residus no són determinants en la formació de PPCDC funcionals ni en A. thaliana, ni en S. cerevisiae. No obstant, es va posar de manifest que l'aminoàcid L405 de ScHal3 és un residu important per la interacció entre Ppz1 i ScHal3 i, per tant, per la regulació de la fosfatasa. Per últim, vam realitzar un mapeig funcional de l'extensió N-terminal de ScHal3 amb l'objectiu de trobar motius rellevants per a la regulació de Ppz1. Després de la caracterització de múltiples versions mutades de ScHal3 hem identificat el motiu 90K-R-X3-VTFS98 com a imprescindible per la inhibició de Ppz1. Els nostres resultats suggereixen que hi deu haver interaccions específiques entre les regions N-terminals de Ppz1 i ScHal3. L'anàlisi comparatiu de proteïnes fúngiques similars a ScHal3 i els assajos fenotípics amb versions híbrides de les proteïnes CaCab3 i CaHal3 de C. albicans ens aporten evidències de que el motiu R/K-R/K-X3-VTFS, o versions lleugerament degenerades, és essencial per la regulació de les Ppz1. Aquest motiu podria ser un determinant de la capacitat moonlighting de les proteïnes tipus Hal3 o Cab3 en fongs. |
|---|