Structural biology and characterization of the human R2TP, an HSP90 co-chaperone complex

166 p.-40 fig.-3 tab.

Detalles Bibliográficos
Autor: Muñoz-Hernández, Hugo
Tipo de recurso: tesis doctoral
Fecha de publicación:2017
País:España
Institución:Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)
Repositorio:DIGITAL.CSIC. Repositorio Institucional del CSIC
OAI Identifier:oai:digital.csic.es:10261/157310
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/10261/157310
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:R2TP
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Chaperona
Bioquímica
Estructura
Función
Crio-microscopia electrónica
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spelling Structural biology and characterization of the human R2TP, an HSP90 co-chaperone complexMuñoz-Hernández, HugoR2TPRuvBL1RuvBL2RPAP3PIH1D1HSP90PIKKsChaperonaBioquímicaEstructuraFunciónCrio-microscopia electrónica166 p.-40 fig.-3 tab.[EN] This thesis presents the research that has been carried out by Hugo Muñoz-Hernández during the last five years. The work has focused on the study of the structure of the human R2TP complex (hR2TP), an HSP90-co-chaperone. The R2TP complex was described for the first time in Saccharomyces cerevisiae. In this organism the complex is formed by Rvb1p, Rvb2p, Tah1p and Pih1p proteins, and these components give the name to the complex (Zhao et al, 2005). The hR2TP has a co-chaperone function and interacts with the "heat shock protein 90" (HSP90) chaperone. R2TP-HSP90 is involved in the biogenesis of the C/D box of small nucleolar ribonucleoprotein (snoRNP), the maturation of phosphatidylinositol-3-kinase related kinases (PIKKs) and the assembly of RNA polymerase II. How hR2TP is able to carry out the correct activation and assembly of these fundamental complexes at the cellular level is still unknown (Kakihara & Houry, 2012). The main contribution from this work is improving our knowledge about the structure of hR2TP. In humans this complex is formed by the following proteins: RuvBL1, RuvBL2, RPAP3 and PIH1D1. We have defined the three-dimensional (3D) structural organization of the hR2TP complex. For this, the RuvBL1-RuvBL2 and RPAP3-PIH1D1 sub-complexes were produced separately and these preparations were used to reconstitute hR2TP in vitro. The main biochemical methods used for protein characterization and analysis of these proteins and their complexes were affinity purifications, pull down experiments, gel filtration chromatography, sucrose gradient and glutaraldehyde cross-linking.Subsequently, the reconstituted hR2TP was analysed by cryo- electron microscopy. From the structure of hR2TP it can be determined that RuvBL1 and RuvBL2 proteins form a platform for the anchoring of RPAP3-PIH1D1. RPAP3 is fundamental in the recruitment process of the RuvBL1-RuvBL2 complex and also the HSP90 chaperone, and we have also started to explore how HSP90 is recruited by the R2TP. In addition, we have started to prepare the protein samples that will be needed in the future to study the recognition of several client proteins by the R2TP. Al together, we provide a first view of the structural architecture of the hR2TP complex, a first step towards understanding important cellular processes that govern the maturation of PIKKs, telomerase and the assembly of RNA polymerase II among others.[ES] Esta tesis recoge la labor de investigación que se ha llevado a cabo en los últimos cinco años y que fundamentalmente se ha centrado en el estudio de la co-chaperona humana R2TP (hR2TP). Resultado de esta tesis es mejor nuestro conocimiento sobre el hR2TP. Este complejo está formado por las proteínas: RuvBL1, RuvBL2, RPAP3 y PIH1D1. El hR2TP tiene una función co-chaperona, siendo capaz de unirse a la chaperona llamada “heat shock protein 90” (HSP90) (Vaughan, 2014; Pearl, 2016). Los mecanismos por los cuales el R2TP humano es capaz de llevar a cabo la correcta activación y el ensamblaje de otros complejos fundamentales a nivel celular son todavía desconocidos. La primera vez que se describió el complejo R2TP fue en la levadura Saccharomyces cerevisiae. En este organismo aparece formado por: Rvb1p, Rvb2p, Tah1p y Pih1p y de ahí su nombre (R2TP) (Zhao et al, 2005). El R2TP tiene una gran importancia celular. Se encuentra involucrado en múltiples procesos biológicos incluyendo la biogénesis de la caja C/D de las ribonucleoproteinas nucleolares pequeñas (snoRNP), apoptosis, maduración de las quinasas similaresa las fosfatidilinositol-3-quinasas (PIKK) y el ensamblaje de la RNA polimerasa II (Kakihara & Houry, 2012). Actualmente se desconocen los mecanismos de actuación por los cuales el R2TP lleva a cabo las funciones de activación y regulación de los procesos celulares en los que participa.Como objetivo de estudio nos propusimos definir la organización estructural tridimensional (3D) del complejo hR2TP. Así como, proporcionar una visión más detallada de los mecanismos de unión a HSP90 y que estabilizan la asociación del complejo chaperona/co-chaperona. En este trabajo se analizó bioquímica y estructuralmente el hR2TP y se propusieron modelos de acción celular de dicho complejo. En primer lugar, se produjeron los sub-complejos RuvBL1-RuvBL2 y RPAP3-PIH1D1 por separado. Ambos complejos se purificaron y analizaron en detalle. Dichas preparaciones, de alta pureza, se utilizaron para reconstituir in vitro el hR2TP. Los principales métodos bioquímicos utilizados para la caracterización y el análisis de las proteínas, fueron ensayos de interacción por afinidad, filtración en gel, gradiente de sacarosa y fijación con glutaraldehído. Posteriormente, el hR2TP ensamblado se analizó por crio-microscopia electrónica. Mediante el procesamiento de las imágenes del hR2TP ha sido posible resolver la estructura tridimensional del mismo alcanzando una resolución promedio de 4.3 Å. De la estructura se puede determinar que las proteínas RuvBL1 y RuvBL2 forman una plataforma para el anclaje de RPAP3-PIH1D1. Estas ultimas son fundamentales en el proceso de reclutamiento de la chaperona HSP90, que es la que finalmente da lugar a la activación y maduración de complejos fundamentales en diversos procesos celulares. El resultado de este trabajo es que gracias a la caracterización estructural a alta resolución del complejo hR2TP hemos podido mejorar nuestro conocimiento sobre los procesos celulares que rigen la maduración de PIKKs, telomerasa y el ensamblaje de RNA polimerasa II entre otros.Proyecto (FPI) SAF2011-22988 del Ministerio de Economía, Industria y CompetitividadPeer reviewedCSIC - Centro de Investigaciones Biológicas Margarita Salas (CIB)Universidad Autónoma de MadridLlorca, ÓscarMinisterio de Economía, Industria y Competitividad (España)Consejo Superior de Investigaciones Científicas [https://ror.org/02gfc7t72]201720172017info:eu-repo/semantics/doctoralThesishttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06http://hdl.handle.net/10261/157310reponame:DIGITAL.CSIC. Repositorio Institucional del CSICinstname:Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)EspañolSíinfo:eu-repo/semantics/openAccessoai:digital.csic.es:10261/1573102026-05-22T06:33:51Z
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