Mecanismes d'alliberació d'ATP a travès de la membrana plasmàtica: paper de la CD39 i les connexines.

L'ATP és una molècula molt carregada elèctricament important per a l'obtenció de l'energia necessària per l'activitat cel·lular. A més a més, també actua com a molècula de senyalització cel·lular. Normalment, la secreció controlada d'ATP té lloc a través de l'exocitosi...

ver descrição completa

Detalhes bibliográficos
Autor: Bahima Borràs, Laia
Formato: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2006
País:España
Recursos:CBUC, CESCA
Repositorio:TDR. Tesis Doctorales en Red
OAI Identifier:oai:www.tdx.cat:10803/2512
Acesso em linha:http://www.tdx.cat/TDX-1024106-090847
http://hdl.handle.net/10803/2512
Access Level:acceso abierto
Palavra-chave:Proteïna CD39
ATP
Activitat cel·lular
Connexines
Ciències de la Salut
616
id ES_97dda89b1d05b87f289e91f3d3ea40eb
oai_identifier_str oai:www.tdx.cat:10803/2512
network_acronym_str ES
network_name_str España
repository_id_str
dc.title.none.fl_str_mv Mecanismes d'alliberació d'ATP a travès de la membrana plasmàtica: paper de la CD39 i les connexines.
title Mecanismes d'alliberació d'ATP a travès de la membrana plasmàtica: paper de la CD39 i les connexines.
spellingShingle Mecanismes d'alliberació d'ATP a travès de la membrana plasmàtica: paper de la CD39 i les connexines.
Bahima Borràs, Laia
Proteïna CD39
ATP
Activitat cel·lular
Connexines
Ciències de la Salut
616
title_short Mecanismes d'alliberació d'ATP a travès de la membrana plasmàtica: paper de la CD39 i les connexines.
title_full Mecanismes d'alliberació d'ATP a travès de la membrana plasmàtica: paper de la CD39 i les connexines.
title_fullStr Mecanismes d'alliberació d'ATP a travès de la membrana plasmàtica: paper de la CD39 i les connexines.
title_full_unstemmed Mecanismes d'alliberació d'ATP a travès de la membrana plasmàtica: paper de la CD39 i les connexines.
title_sort Mecanismes d'alliberació d'ATP a travès de la membrana plasmàtica: paper de la CD39 i les connexines.
dc.creator.none.fl_str_mv Bahima Borràs, Laia
author Bahima Borràs, Laia
author_facet Bahima Borràs, Laia
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Solsona Sancho, Carles
Blasi Cabús, Joan
Universitat de Barcelona. Departament de Patologia i Terapèutica Experimental
dc.subject.none.fl_str_mv Proteïna CD39
ATP
Activitat cel·lular
Connexines
Ciències de la Salut
616
topic Proteïna CD39
ATP
Activitat cel·lular
Connexines
Ciències de la Salut
616
description L'ATP és una molècula molt carregada elèctricament important per a l'obtenció de l'energia necessària per l'activitat cel·lular. A més a més, també actua com a molècula de senyalització cel·lular. Normalment, la secreció controlada d'ATP té lloc a través de l'exocitosi de grànuls o vesícules. Tot i això, en algunes cèl·lules, altres mecanismes poden controlar l'alliberació d'ATP. En aquesta tesi s'han estudiat dos d'aquests mecanismes: l'alliberació d'ATP a través de la proteïna CD39 i l'alliberació d'ATP a través de connexines.<br/>La CD39, o NTPDasa 1, és una proteïna que hidrolitza nucleòtids trifosfat i difosfat fins a nucleòtids monofosfat. Resultats anteriors del nostre laboratori suggerien que, aplicant polsos hiperpolaritzants en la membrana dels oòcits de Xenopus, l'ectoenzim NTPDasa1 podia esdevenir permeable per l'ATP. Continuant amb l'estudi d'aquesta proteïna, es va voler determinar també si estava relacionada amb l'alliberació d'ATP induïda per estrès hipertònic descrita en oòcits. Per portar a terme aquests estudis, era necessari aconseguir un oligonucleòtid antisentit contra la CD39 dels oòcits de Xenopus. Per tant, el nostre primer objectiu va ser sintetitzar i validar aquest oligonucleòtid, per tal de poder-lo utilitzar posteriorment a l'hora de fer els experiments. Mitjançant el disseny de dos oligonucleòtids antisentit per dita proteïna es va mesurar l'alliberació d'ATP en grups d'oòcits injectats amb els oligonucleòtids i en grups control, després de ser sotmesos a un xoc hiperosmòtic. Al mateix temps, per a comprovar l'efectivitat dels oligonucleòtids injectats, es va mesurar l'activitat ATPàsica en aquests oòcits. Es va observar com l'antisentit per la CD39 reduïa de manera significativa l'alliberació d'ATP i el corrent iònic després de 13 minuts d'exposició hipertònica.<br/>Els hemicanals, formats per connexines, és un altre dels possibles mecanismes de regulació de l'alliberació d'ATP. En les gap junctions, les connexines uneixen el citoplasma de dues cèl·lules adjacents establint un canal intercel·lular que permet el pas d'ions i molècules més petites d'1 KDa. Es va estudiar aquest mecanisme en oòcits de Xenopus, estudiant la Cx38, un tipus específic de connexina endògena dels oòcits, i la Cx32, expressada en els oòcits de manera heteròloga. <br/>En els experiments amb la Cx38, vam observar que solucions lliures d'ions divalents activaven un corrent d'entrada en els oòcits que era inhibit per octanol i àcid flufenàmic, dos inhibidors de les gap junctions. Aquest corrent sensible a calci, depenia de l'expressió de Cx38: disminuïa en oòcits injectats amb un oligonucleòtid antisentit per la Cx38 (ASCx38) i augmentava en oòcits que sobrexpressaven la Cx38. A més, l'activació dels hemicanals de Cx38 induïa l'alliberació d'ATP, la qual era inhibida per l'àcid flufenàmic, l'octanol i l'ASCx38 i augmentada en la sobrexpressió de Cx38. Aquests resultats suggerien que l'activació dels hemicanals era responsable de l'alliberació d'ATP en els oòcits de Xenopus.<br/>D'altra banda, vam investigar l'alliberació d'ATP a través dels hemicanals formats per Cx32 expressada en oòcits. Aquesta proteïna s'expressa en la majoria d'òrgans humans, però, particularment, mutacions de la Cx32 en les cèl·lules de Schwann produeixen la malaltia de Charcot-Marie-Tooth lligada al cromosoma X (CMTX). En oòcits que expressen la Cx32, vam combinar l'ús de tècniques de fixació de voltatge per registrar els corrents iònics generats pels hemicanals i la reacció bioluminiscent de la luciferina-luciferasa per mesurar l'alliberació d'ATP. Els hemicanals formats per la Cx32 eren estimulats mitjançant polsos despolaritzants generant un corrent iònic de sortida. Després de l'estimulació, en el període de repolarització, hi havia un corrent de cua que coincidia amb el moment d'alliberació d'ATP. L'àrea d'aquest corrent tenia una relació lineal amb la quantitat d'ATP alliberada. <br/>El conjunt de resultats d'aquesta tesi ens suggereixen que, tant les connexines com la CD39, participen en l'alliberació d'ATP a través de la membrana plasmàtica.
publishDate 2006
dc.date.none.fl_str_mv 2006
2006
2006
2011
dc.type.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
info:eu-repo/semantics/publishedVersion
format doctoralThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.none.fl_str_mv http://www.tdx.cat/TDX-1024106-090847
http://hdl.handle.net/10803/2512
url http://www.tdx.cat/TDX-1024106-090847
http://hdl.handle.net/10803/2512
dc.language.none.fl_str_mv Catalán
language_invalid_str_mv Catalán
dc.rights.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
application/pdf
dc.publisher.none.fl_str_mv Universitat de Barcelona
publisher.none.fl_str_mv Universitat de Barcelona
dc.source.none.fl_str_mv TDX (Tesis Doctorals en Xarxa)
reponame:TDR. Tesis Doctorales en Red
instname:CBUC, CESCA
instname_str CBUC, CESCA
reponame_str TDR. Tesis Doctorales en Red
collection TDR. Tesis Doctorales en Red
repository.name.fl_str_mv
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1869414114515746816
spelling Mecanismes d'alliberació d'ATP a travès de la membrana plasmàtica: paper de la CD39 i les connexines.Bahima Borràs, LaiaProteïna CD39ATPActivitat cel·lularConnexinesCiències de la Salut616L'ATP és una molècula molt carregada elèctricament important per a l'obtenció de l'energia necessària per l'activitat cel·lular. A més a més, també actua com a molècula de senyalització cel·lular. Normalment, la secreció controlada d'ATP té lloc a través de l'exocitosi de grànuls o vesícules. Tot i això, en algunes cèl·lules, altres mecanismes poden controlar l'alliberació d'ATP. En aquesta tesi s'han estudiat dos d'aquests mecanismes: l'alliberació d'ATP a través de la proteïna CD39 i l'alliberació d'ATP a través de connexines.<br/>La CD39, o NTPDasa 1, és una proteïna que hidrolitza nucleòtids trifosfat i difosfat fins a nucleòtids monofosfat. Resultats anteriors del nostre laboratori suggerien que, aplicant polsos hiperpolaritzants en la membrana dels oòcits de Xenopus, l'ectoenzim NTPDasa1 podia esdevenir permeable per l'ATP. Continuant amb l'estudi d'aquesta proteïna, es va voler determinar també si estava relacionada amb l'alliberació d'ATP induïda per estrès hipertònic descrita en oòcits. Per portar a terme aquests estudis, era necessari aconseguir un oligonucleòtid antisentit contra la CD39 dels oòcits de Xenopus. Per tant, el nostre primer objectiu va ser sintetitzar i validar aquest oligonucleòtid, per tal de poder-lo utilitzar posteriorment a l'hora de fer els experiments. Mitjançant el disseny de dos oligonucleòtids antisentit per dita proteïna es va mesurar l'alliberació d'ATP en grups d'oòcits injectats amb els oligonucleòtids i en grups control, després de ser sotmesos a un xoc hiperosmòtic. Al mateix temps, per a comprovar l'efectivitat dels oligonucleòtids injectats, es va mesurar l'activitat ATPàsica en aquests oòcits. Es va observar com l'antisentit per la CD39 reduïa de manera significativa l'alliberació d'ATP i el corrent iònic després de 13 minuts d'exposició hipertònica.<br/>Els hemicanals, formats per connexines, és un altre dels possibles mecanismes de regulació de l'alliberació d'ATP. En les gap junctions, les connexines uneixen el citoplasma de dues cèl·lules adjacents establint un canal intercel·lular que permet el pas d'ions i molècules més petites d'1 KDa. Es va estudiar aquest mecanisme en oòcits de Xenopus, estudiant la Cx38, un tipus específic de connexina endògena dels oòcits, i la Cx32, expressada en els oòcits de manera heteròloga. <br/>En els experiments amb la Cx38, vam observar que solucions lliures d'ions divalents activaven un corrent d'entrada en els oòcits que era inhibit per octanol i àcid flufenàmic, dos inhibidors de les gap junctions. Aquest corrent sensible a calci, depenia de l'expressió de Cx38: disminuïa en oòcits injectats amb un oligonucleòtid antisentit per la Cx38 (ASCx38) i augmentava en oòcits que sobrexpressaven la Cx38. A més, l'activació dels hemicanals de Cx38 induïa l'alliberació d'ATP, la qual era inhibida per l'àcid flufenàmic, l'octanol i l'ASCx38 i augmentada en la sobrexpressió de Cx38. Aquests resultats suggerien que l'activació dels hemicanals era responsable de l'alliberació d'ATP en els oòcits de Xenopus.<br/>D'altra banda, vam investigar l'alliberació d'ATP a través dels hemicanals formats per Cx32 expressada en oòcits. Aquesta proteïna s'expressa en la majoria d'òrgans humans, però, particularment, mutacions de la Cx32 en les cèl·lules de Schwann produeixen la malaltia de Charcot-Marie-Tooth lligada al cromosoma X (CMTX). En oòcits que expressen la Cx32, vam combinar l'ús de tècniques de fixació de voltatge per registrar els corrents iònics generats pels hemicanals i la reacció bioluminiscent de la luciferina-luciferasa per mesurar l'alliberació d'ATP. Els hemicanals formats per la Cx32 eren estimulats mitjançant polsos despolaritzants generant un corrent iònic de sortida. Després de l'estimulació, en el període de repolarització, hi havia un corrent de cua que coincidia amb el moment d'alliberació d'ATP. L'àrea d'aquest corrent tenia una relació lineal amb la quantitat d'ATP alliberada. <br/>El conjunt de resultats d'aquesta tesi ens suggereixen que, tant les connexines com la CD39, participen en l'alliberació d'ATP a través de la membrana plasmàtica.<i>ATP is an electrically charged molecule required to obtain the energy necessary for cellular activity; in addition, it is an intercellular signaling molecule. Usually, the controlled secretion of ATP occurs through the exocytosis of granules and vesicles. However, in some cells, other mechanisms control ATP release. Two of these mechanisms have been studied in this thesis: ATP release through CD39 and ATP release through connexin hemichannels. <br/><br/>CD39, or NTPDasa 1, is a protein that hydrolyze nucleotide triphosphates and nucleotide diphosphates to nucleotide monophosfates. To study its relationship with ATP release we have synthetized an antisense oligonucleotide against Xenopus oocyte CD39. Our results indicate that the antisense against CD39 significanty reduce ATP release and also the ionic current due to the activation of CD39 by hypertonic solution. <br/>It has been suggested that hemichannels, formed by connexins, may be an alternative pathway for ATP release. In gap junctions, connexins link the cytoplasm of two adjacent cells by establishing an intercellular channel. We have investigated the release of ATP from Xenopus oocytes through hemichannels formed by connexin 38 (Cx38), an endogenous, specific type of connexin, and by connexin32 (Cx32) heterologously expressed in Xenopus oocytes. <br/>In Xenopus oocytes, calcium-free solution reversibly activates an inward current that is inhibited by octanol and flufenamic acid. This calcium-sensitive current depends on Cx38 expression: it's decreased in oocytes injected with an antisense oligonucleotide against Cx38 (ASCx38) and is increased in oocytes overexpressing Cx38. Moreover, the activation of Cx38 also induce the release of ATP, which is inhibited by flufenamic acid, octanol and ASCx38 and increased by Cx38 overexpression. <br/><br/>Connexin 32 is expressed in most of human organs but, particularly, Cx32 mutations present in Schwann cells produce X-linked Charcot-Marie-Tooth disease. In oocytes expressing Cx32, application of depolarizing pulses to positive potentials induce outward hemichannel currents that become inward during the repolarization phase. The release of ATP occurred during the repolarization period and the amount of ATP released correlate with the area of the tail current. </I>Universitat de BarcelonaSolsona Sancho, CarlesBlasi Cabús, JoanUniversitat de Barcelona. Departament de Patologia i Terapèutica Experimental2011200620062006info:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionapplication/pdfapplication/pdfhttp://www.tdx.cat/TDX-1024106-090847http://hdl.handle.net/10803/2512TDX (Tesis Doctorals en Xarxa)reponame:TDR. Tesis Doctorales en Redinstname:CBUC, CESCACatalánADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.info:eu-repo/semantics/openAccessoai:www.tdx.cat:10803/25122026-06-14T12:46:07Z
score 15,300719

Registos relacionados