Estratègies de co-transformació per eliminar els gens de selecció i avaluació del flux de gens en plantes transgèniques d'arròs
En el procés de transformació genètica tan sols un petit percentatge de cèl·lules accepta la integració de DNA forà mentre que la majoria de cèl·lules romanen com a no transgèniques. Habitualment s'introdueix juntament amb el gen d'interès un gen de selecció, que permet el creixement única...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2007 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | catalán |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:37844 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/37844 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Transformacions genètiques Gens Plantes transgèniques |
| Sumario: | En el procés de transformació genètica tan sols un petit percentatge de cèl·lules accepta la integració de DNA forà mentre que la majoria de cèl·lules romanen com a no transgèniques. Habitualment s'introdueix juntament amb el gen d'interès un gen de selecció, que permet el creixement únicament de les cèl·lules transformades. Fins ara els gens de selecció més utilitzats són els que confereixen resistència a antibiòtics o a herbicides. A més dels possibles riscs sanitaris i/o mediambientals que pot comportar l'ús d'aquests gens (fins ara no demostrats) hi ha una normativa europea (EU 2001/18/EC) que en prohibeix l'ús. A nivell científic, la presència d'aquests gens és totalment prescindible un cop s'han seleccionat les cèl·lules transformades. Per tot això, en els darrers anys s'han establert diverses estratègies per eliminar els gens de selecció en plantes transgèniques. Aquest treball s'ha centrat en estudiar diferents vies de co-transformació de dos gens, el d'interès i el de selecció, amb la finalitat d'establir el millor sistema per obtenir per segregació de caràcters en la descendència, plantes transgèniques d'arròs (Oryza sativa L.) lliures de gens de selecció. S'han utilitzat gens marcadors de fàcil identificació com el gen gfp (green fluorescent protein), el gen bar (resistència al herbicida glufosinat d'amoni) i el gen uidA (?-glucuronidasa) per obtenir les taxes de co-transformació en T0 i per avaluar la segregació de caràcters en T1. S'han dissenyat diferents estratègies de co-transformació tan per Agrobacterium tumefaciens com per biolística. Mitjançant la transformació genètica per Agrobacterium tumefaciens s'ha provat a) la inoculació del call d'arròs amb dues poblacions d'Agrobacterium, cadascuna portadora d'un plàsmid amb un gen marcador diferent. Les inoculacions s'han realitzat simultàniament en el temps i deixant dos i cinc dies de decalatge entre una i altra; b) inoculació amb una soca d'Agrobacterium portadora de dos plàsmids, cadascun amb un gen marcador; i c) inoculació amb una soca d'Agrobacterium portadora d'un plàsmid amb dues regions de DNA de transferència, el doble T-DNA. Per biolística s'han realitzat experiments en què en comptes de disparar amb plàsmids sencers s'ha fet amb DNA monocatenari. Les aplicacions dels T-DNA monocatenaris es van realitzar simultàniament en el temps i amb decalatge de dos i cinc dies. Els resultats dels estudis de les estratègies portades a terme per Agrobacterium tumefaciens van ser els següents: inoculant simultàniament amb dos cultius bacterians es va obtenir una taxa de co-transformació baixa però suficient per permetre l'obtenció de plantes descendents que segreguin pels dos caràcters. En canvi, l'estratègia de deixar temps de decalatge entre les inoculacions no va afavorir la inserció del nou caràcter en un locus independent sinó que els resultats suggereixen que el teixit vegetal podria activar mecanismes de defensa que bloquegen una segona inserció de material genètic a curt termini. No va resultar efectiva l'estratègia d'inocular amb una soca bacteriana portadora de dos plàsmids diferents segurament per la gran similitud entre els dos plàsmids utilitzats, implicant el desplaçament d'un dels dos plàsmids i impossibilitant l'obtenció de plantes co-transformades. Tot i que caldria ajustar alguns paràmetres per obtenir els resultats esperats per biolística, s'ha demostrat la funcionalitat d'almenys un dels T-DNA monocatenaris. Finalment l'estratègia que va resultar més eficaç i viable va ser la del doble T-DNA, obtenint una taxa de co-transformació del 69'7% amb plantes que a més havien integrat en la majoria dels casos entre una i dues còpies de cada gen. La tècnica del doble T-DNA ens ha permès obtenir diverses línies homozigòtiques de plantes d'arròs portadores d'un dels gens marcadors lliures de gens de selecció. Aplicant la tècnica del doble T-DNA es va substituir un dels gens marcadors per un gen d'interès, el CryIB, que codifica per una endotoxina de Bacillus turingensis, que confereix resistència a la planta transgènica enfront al barrinador de l'arròs Chilo supressalis,. Amb l'estratègia del doble T-DNA es van obtenir plantes d'arròs amb el gen d'interès CryIB i sense gens de selecció. Un altre aspecte que s'ha abordat a la tesi és l'estudi de flux genètic entre plantes transgèniques d'arròs, plantes no transgèniques i arròs salvatge. En aquest sentit és va dissenyar un experiment en camp per confirmar els resultats obtinguts en assaigs anteriors sobre l'efecte de la distància i dels vents dominants en l'encreuament entre plantes transgèniques i plantes no transgèniques de la mateixa varietat d'arròs, així com avaluar la taxa d'encreuament amb l'arròs salvatge situat entremig del camp o bé a diferents distàncies. Els resultats obtinguts, juntament amb les característiques particulars de les varietats d'arròs suggereixen que la coexistència és possible entre cultius transgènics, tradicionals i ecològics d'arròs. Tanmateix, en el cas de l'arròs salvatge les mesures de coexistència hauran d'incloure, molt probablement, alguna estratègia que permeti minimitzar la presència d'aquesta mala herba als camps d'arròs. |
|---|