Structural and functional characterization of MuB protein involved in DNA targeting for transposition

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 02-09-2014

Detalhes bibliográficos
Autor: Dramićanin, Marija
Formato: tesis doctoral
Fecha de publicación:2014
País:España
Recursos:Universidad Autónoma de Madrid
Repositorio:Biblos-e Archivo. Repositorio Institucional de la UAM
Idioma:español
inglés
OAI Identifier:oai:repositorio.uam.es:10486/662755
Acesso em linha:http://hdl.handle.net/10486/662755
Access Level:acceso abierto
Palavra-chave:Genomas - Tesis doctorales
Proteínas - Transporte fisiológico - Tesis doctorales
Biología y Biomedicina / Biología
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spelling Structural and functional characterization of MuB protein involved in DNA targeting for transpositionDramićanin, MarijaGenomas - Tesis doctoralesProteínas - Transporte fisiológico - Tesis doctoralesBiología y Biomedicina / BiologíaTesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 02-09-2014DNA transposons are ubiquitous in the genomes of all forms of life and play important evolutionary roles in generating gene diversity and in shaping genomic landscapes. Mu phage is one of the most complex and efficient DNA transposon. Mu transposition requires two phage-­‐encoded proteins: the transposase MuA and the accessory protein MuB. MuB is an ATP-­‐dependent non-­‐specific DNA binding protein that regulates the activity of the MuA transposase and captures target DNA for transposition. Mechanistic understanding of MuB function has previously been hindered by its poor solubility and tendency to aggregate. We combined bioinformatic, mutagenic, biochemical, electron microscopic and NMR analyses to unmask the structure and function of MuB. We demonstrate that MuB is an AAA+ ATPase composed of an N-­‐terminal appendage and an AAA+ ATPase module that upon ATP binding forms helical filaments on the DNA. We also identify critical residues for its ATPase, DNA binding, protein polymerization and MuA interaction activities. Using single-­‐particle electron microscopy, we show that MuB assembles into helical filaments that coat the DNA without deforming it, resulting in a unique protein-­‐DNA symmetry mismatch. These findings, together with the influence of MuB-­‐filament size on strand-­‐transfer efficiency, lead to a model in which MuB-­‐ imposed symmetry transiently deforms the DNA at the boundary of the MuB filament and results in a bent DNA favored by MuA for transposition. We have also observed the tendency of the MuB filaments to form bundles in an N-­‐terminal appendage dependent manner. The structure of the N-­‐terminal appendage was solved by NMR spectroscopy. The N-­‐terminal appendage is strikingly similar to the λ-­‐ repressor like DNA-­‐binding domains, strongly suggesting that this MuB domain could be involved in DNA recognition. This led us to propose a new model of Mu phage target immunity in which filament-­‐filament interactions mediated by the N-­‐terminal appendage could aid in the condensation of the phage DNA, occluding it from the transposase.Los transposones de ADN son ubicuos en los genomas de todos los seres vivos y juegan un papel evolutivo importante en la generación de diversidad génica y en la definición de los genomas. El bacteriófago Mu es uno de los transposones de ADN más complejos y efectivos. La transposición de Mu requiere dos proteínas codificadas por el fago: la transposasa MuA y la proteína accesoria MuB. MuB es una proteína de unión a ADN dependiente de ATP que regula la actividad de la transposasa y captura el ADN diana para la transposición. La comprensión de la función de MuB a nivel mecanístico se ha visto dificultada por su baja solubilidad y su tendencia a agregar. Hemos combinado análisis bioinformatico, mutagénesis, bioquímica, microscopía electrónica y NMR para desenmascarar la estructura y la función de MuB. Demostramos que MuB es una ATPasa AAA+ compuesta de un apéndice N-­‐terminal y un módulo AAA+ que al unir ATP forma filamentos helicoidales sobre el ADN. También hemos identificado residuos clave para la unión e hidrólisis del ATP, unión al ADN, polimerización e interacción con MuA. Usando miscroscopía electrónica de partículas individuales mostramos que MuB se ensambla en filamentos helicoidales que cubren el ADN sin deformarlo, resultando en un mal emparejamiento único. Estos resultados, junto a resultados de cómo el tamaño de los filamentos de MuB afecta a la eficiencia de la transposición, sugieren un modelo según el cual la simetría impuesta por el filamento de MuB deforma transitoriamente el ADN al final del filamento, presentándolo como un mejor sustrato para la transposasa MuA. Hemos observado también la tendencia de los filamentos de MuB a formar haces de un modo que depende del apéndice N-­‐ terminal. Hemos resuelto la estructura del apéndice N-­‐terminal mediante espectroscopía de RMN. El apéndice N-­‐terminal es sorprendentemente similar a los dominios de unión de ADN de la familia del represor λ, sugiriendo que este dominio de MuB podría estar implicado en el reconocimiento del ADN. Estos resultados nos llevan a proponer un nuevo mecanismo de inmunidad del fago Mu, en el que las interacciones entre filamentos mediadas por el apéndice N-­‐terminal podrían ayudar a la condensación del genoma de Mu, ocultándolo así de la acción de la transposasa. xviiiRamón-­Maiques, SantiagoDepartamento de Biología MolecularFacultad de CienciasCentro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO)20142014-09-02doctoral thesishttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06NAhttp://purl.org/coar/version/c_be7fb7dd8ff6fe43info:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10486/662755reponame:Biblos-e Archivo. Repositorio Institucional de la UAMinstname:Universidad Autónoma de MadridEspañolspaInglésengopen accesshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2info:eu-repo/semantics/openAccessoai:repositorio.uam.es:10486/6627552026-06-23T12:46:27Z
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