Enhancement of virus-like particle production in HEK293 cell cultures
Les virus-like particles (VLP) tenen un gran potencial com a candidats pel desenvolupament de vacunes. En aquest treball, s'han aplicat diverses estratègies per la millora de la producció de VLPs (basades en la poliproteïna Gag del VIH-1) en HEK293 mitjançant la transfecció transitòria i l'...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de documento: | tese |
| Data de publicação: | 2018 |
| País: | España |
| Recursos: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositório: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglês |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:201252 |
| Acesso em linha: | https://ddd.uab.cat/record/201252 |
| Access Level: | Acceso aberto |
| Palavra-chave: | Bioreactors Vacunes Cultius cel·lulars |
| Resumo: | Les virus-like particles (VLP) tenen un gran potencial com a candidats pel desenvolupament de vacunes. En aquest treball, s'han aplicat diverses estratègies per la millora de la producció de VLPs (basades en la poliproteïna Gag del VIH-1) en HEK293 mitjançant la transfecció transitòria i l'expressió estable. Aquest candidat té aplicacions potencials en el desenvolupament d'una vacuna terapèutica contra la SIDA. Tres capítols del treball descriuen estratègies basades en la transfecció transitòria, mentre que l'últim capítol consisteix en la generació d'una línea HEK293 estable per la producció de VLPs de VIH-1. En el primer capítol, es va dur a terme la combinació de l'estratègia extended gene expression (EGE) amb la complementació del medi amb additius químics. L'EGE (basada en la repetició de diversos recanvis de medi i retransfeccions) ha reportat una millora en la producció de VLPs de 12 cops mentre que la complementació química del medi amb potenciadors de l'expressió gènica comporta una millora de 4 cops. La combinació de l'EGE amb additius químics va resultar en una millora de 1.5 cops en la producció de VLPs de VIH- 1 comparat amb l'EGE sola. Com alternativa a l'ús d'additius químics, es va provar l'expressió de shRNA que produeixin el mateix efecte sobre les cèl·lules. Aquesta estratègia innovadora va millorar la producció de VLP en 2.3 cops sense cap detriment sobre la viabilitat cel·lular. Finalment, la combinació dels shRNA amb l'EGE va comportar una millora en la producció de VLPs de 1.3 cops, comparat amb el protocol tradicional d'EGE. En el segon capítol de la tesi, es va dur a terme l'escalat a nivell de reactor d'EGE, obtenint una producció de VLP comparable a l'erlenmeyer. El bioreactor va permetre l'assoliment de densitats cel·lulars i creixements específics molts més alts. Degut al major creixement en el bioreactor, el percentatge final de cèl·lules GFP positives era considerablement menor que a l'erlenmeyer, la qual cosa podria ser millorada ampliant el nombre de retransfeccions realitzades al cultiu cel·lular. L'anàlisi per quantificació de nanopartícules va revelar un ratio de VLPs respecte a partícules totals més alt en el cas de l'erlenmeyer que en el reactor; possiblement degut a les altes densitat cel·lulars del bioreactor. La metodologia d'EGE va poder ser escala satisfactòriament a nivell de reactor per primer cop, mantenint les produccions de GagGFP. En el tercer capítol, es va realitzar l'optimització de les concentracions de DNA i PEI usades a la transfecció transitòria per a tres línies HEK293 diferents i tres plasmidis d'expressió. Les concentracions de DNA i PEI optimitzades per a les nou combinacions van ser molt similar per tots el casos; el que ens indica que l'eficiència de transfecció depèn de la quantitat concreta de DNA i PEI emprada. A més, dues de les tres línies reconeixen orígens de replicació específics. Els orígens de replicació estan inclosos a les seqüències dels vectors per tal de provar la seva capacitat d'augmentar la producció de VLPs. El sistema HEK293E/OriP va ser l'escollit perquè permet una millora de la producció de VLPs de VIH-1 de 3 cops, mantenint les mateixes densitats i viabilitats cel·lulars comparat amb un plasmidi control. En l'últim capítol d'aquest treball, es va dur a terme la generació d'una línea estable de HEK293 per l'expressió de VLPs. Després d'un procés de selecció basat en la producció, es van seleccionen cinc clons per l'adaptació a suspensió i a medis lliures de sèrum. El clon 10H9 va presentar un temps de duplicació i una densitat cel·lular màxima semblant a la resta de clons i va assolir una la màxima productivitat específica; per tant, va ser seleccionat com a productor de VLPs. |
|---|