Optimización del sistema replicativo del bacteriófago ϕ29 para aplicaciones biotecnológicas

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 17-06-2015

Detalhes bibliográficos
Autor: Gella Montero, Pablo
Formato: tesis doctoral
Fecha de publicación:2016
País:España
Recursos:Universidad Autónoma de Madrid
Repositorio:Biblos-e Archivo. Repositorio Institucional de la UAM
Idioma:español
OAI Identifier:oai:repositorio.uam.es:10486/674781
Acesso em linha:http://hdl.handle.net/10486/674781
Access Level:acceso abierto
Palavra-chave:Bacteriófagos - Genética - Tesis doctorales
Biología y Biomedicina / Biología
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Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBM)
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spelling Optimización del sistema replicativo del bacteriófago ϕ29 para aplicaciones biotecnológicasGella Montero, PabloBacteriófagos - Genética - Tesis doctoralesBiología y Biomedicina / BiologíaTesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 17-06-2015Hace años nuestro laboratorio describió un sistema mínimo para la amplificación eficiente in vitro del genoma del bacteriófago ϕ29 basado en 4 proteínas codificadas por el propio virus: la DNA polimerasa, la proteína terminal (TP), la proteína de unión a DNA de banda simple (p5) y la proteína de unión a DNA de banda doble (p6). Sin embargo, hasta el momento no se había desarrollado un sistema similar para la producción de DNAs heterólogos unidos a una TP. En la presente tesis doctoral se ha adaptado el sistema de amplificación cebado por TP a DNAs que no tienen una TP unida inicialmente a sus extremos 5’. Esto se ha realizado mediante el diseño de distintos abordajes que permiten flanquear los DNAs a amplificar con las secuencias terminales del genoma de ϕ29, y se ha demostrado la posibilidad de obtener con ellos una amplificación eficiente in vitro cuyo producto es un DNA heterólogo unido covalentemente a una TP en cada uno de sus extremos 5’. Con el fin de comprender los eventos tempranos y para encontrar orígenes de replicación mejorados para la amplificación cebada por TP, en la presente tesis doctoral se ha realizado un estudio sistemático de diferentes secuencias y estructuras terminales en orígenes artificiales de dsDNA. Se observó que la eficiencia del origen estaba determinada por una combinación de factores, entre ellos la secuencia y el desapareamiento de la doble banda y, además, era necesario el reconocimiento de una estructura tipo ‘origen’ (dsDNA y romo). El origen más eficiente obtenido (30 veces la actividad wild-type) tenía la secuencia CCC en el extremo 3’ de la hebra molde, AAA en el extremo 5’ de la hebra desplazada y los 6 primeros pares de bases desapareados. El incremento en la actividad de los orígenes mejorados parecía ser el resultado de la reducción de una barrera termodinámica en la etapa de transición. Trabajos anteriores han demostrado que el dominio N-terminal de la TP presenta capacidad de unión a DNA de forma inespecífica de secuencia. En la presente tesis doctoral se propuso generar una unión específica como forma de mejorar el acceso de la maquinaria de replicación al origen y, por lo tanto, la eficiencia de replicación. Para ello, se sustituyó el dominio N-terminal de la TP por el dominio de unión a DNA del factor de transcripción GAL4 y se generó una diana de reconocimiento para GAL4 haciendo los mínimos cambios posibles en un origen basado en la secuencia del extremo derecho de ϕ29. Sin embargo, la proteína no resultó funcional, habiendo perdido la capacidad de unión a DNA. La unión del genoma de ϕ29 a la TP, codificada por él mismo, hace del sistema del bacteriófago ϕ29 una plataforma muy interesante para fusionar nuevas funciones a un DNA y desarrollar aplicaciones tipo DNA display. En la presente tesis doctoral, se ha empleado la transposición al azar de GFP en la secuencia de la TP con el objeto de encontrar sitios potenciales de inserción seleccionando 12 proteínas que fueron analizadas con el sistema replicativo de ϕ29. De éstas, una permite una inserción de hasta 17 aminoácidos en su secuencia, manteniendo la funcionalidad de la proteína, y puede ser la base de nuevas tecnologías que aún están en proceso de desarrollo, concretamente para la transferencia de genesSome years ago our laboratory described a minimal system for the in vitro efficient amplification of the genome of bacteriophage ϕ29. This minimal system is based in 4 phage-encoded proteins: DNA polymerase (p2), Terminal Protein (TP), single-stranded DNA binding protein (p5) and double-stranded DNA binding protein (p6). Until now, this amplification system has not been developed to produce defined TP-linked heterologous DNAs in a fashion similar to the amplification of the phage ϕ29 genome. In the present work we adapt this system to DNAs lacking a TP in their 5’ ends. For that, we have designed different approaches that allow the flanking of these ends with the terminal sequences of the genome of ϕ29, demonstrating the possibility of obtaining an in vitro efficient amplification whose product is an heterologous DNA covalently linked to a TP at both 5’ ends. To understand the early replication events and find improved replication origins for the TPprimed amplification, we systematically analyzed different sequences and terminal structures in dsDNA artificial origins. We observed that origin efficiency depends on several factors like the sequence and the double strand unpairing, and also that a structurally recognizable origin was needed (dsDNA and blunt). The strongest origin (30-fold wild-type activity) had the sequence CCC at the 3’ end, AAA at the 5’ end and its 6 first base pairs unpaired. The increased activity of the origins seemed to be the result of the reduction of a thermodynamic barrier at the transition step. Previous works have shown that the TP N-terminal domain possesses non-specific DNA binding capacity in vitro. In this work, we proposed generating a specific DNA binding to improve the access of the replication machinery to the origin and, therefore, the replication efficiency. For this, we replaced the TP N-terminal domain with the DNA binding domain of the GAL4 transcription factor. We also generated the recognition target for GAL4 on an origin based in the right ϕ29 DNA end sequence making the minimum number of changes possible. However, the protein was not functional, having lost the DNA binding ability. The linkage of the ϕ29 genome to the TP, encoded by itself, makes the bacteriophage ϕ29 system an interesting platform to fuse new functions to a DNA or to develop applications such as DNA display. In this work, we used the random GFP transposition into the TP sequence to find potencial insertion sites. We selected 12 proteins that were analyzed with the replicative system of ϕ29. One of these proteins has proved to be active even with a 17 amino acid insertion, and it could be the basis for new technologies that are still under development, namely gene transferEsta Tesis Doctoral ha sido realizada en el Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC/UAM) bajo la dirección de la Doctora Margarita Salas Falgueras y el Doctor Mario Mencía Caballero. Para su realización se contó con una beca predoctoral de la Junta para la Ampliación de Estudios (JAE) del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)Salas Falgueras, MargaritaMencía Caballero, MarioDepartamento de Biología MolecularFacultad de CienciasCentro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBM)20162016-06-17doctoral thesishttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06NAhttp://purl.org/coar/version/c_be7fb7dd8ff6fe43info:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10486/674781reponame:Biblos-e Archivo. Repositorio Institucional de la UAMinstname:Universidad Autónoma de MadridEspañolspaopen accesshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2info:eu-repo/semantics/openAccessoai:repositorio.uam.es:10486/6747812026-06-23T12:46:27Z
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