Human sperm transcriptome
Se ha demostrado que la contribución del espermatozoide al embrión va más allá de la transmisión del genoma paterno. Diversos estudios han mostrado que el espermatozoide humano contiene una compleja población de RNAs implicados en funciones relacionadas con la fertilidad. Por tanto, la visión de est...
| Autor: | |
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| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2020 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglés |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:233682 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/233682 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Espermatozoides RNA Fecunditat |
| Sumario: | Se ha demostrado que la contribución del espermatozoide al embrión va más allá de la transmisión del genoma paterno. Diversos estudios han mostrado que el espermatozoide humano contiene una compleja población de RNAs implicados en funciones relacionadas con la fertilidad. Por tanto, la visión de estas moléculas como meros restos de eventos previos ha quedado atrás. Este nuevo paradigma abre las puertas a nuevas aplicaciones del RNA en el ámbito de los biomarcadores de fertilidad. Sin embargo, los análisis transcriptómicos en espermatozoides presentan diversas limitaciones debidas a la heterogeneidad y delicada naturaleza de estas moléculas, además de la poca cantidad de RNA contenida en dichas células.En este contexto, el objetivo de esta Tesis Doctoral es caracterizar el transcriptoma del espermatozoide humano y establecer las bases para desarrollar nuevos biomarcadores de fertilidad masculina. Dentro de este objetivo, se plantearon las siguientes metas: 1) optimizar metodologías específicas para analizar el RNA espermático mediante qRT-PCR y RNA-seq; 2) proporcionar un perfil integrado y una caracterización funcional de los mRNAs y lncRNAs espermáticos mediante RNA-seq; y 3) establecer nuevos biomarcadores de fertilidad a partir de la carga transcriptómica del espermatozoide.Con este propósito, se adaptaron tanto el protocolo experimental como el análisis de datos a las limitaciones propias del RNA espermático y a la tecnología transcriptómica usada. Por tanto, se implementaron métodos de eliminación de células no espermáticas de las muestras seminales, así como controles de calidad para asegurar la ausencia de DNA y RNA no espermático. Además, se usó un método basado en solventes orgánicos para los estudios qRT-PCR, y kits de solventes no orgánicos para RNA-seq.Los datos obtenidos se normalizaron usando métodos específicos de la técnica empleada. En concreto, para la normalización de los datos de expresión de miRNAs espermáticos en estudios singleplex qRT-PCR era necesario establecer miRNAs normalizadores. Esto se consiguió comparando los resultados derivados de unos datos que se normalizaron mediante: i) el método Mean-Centering Restricted (MCR); y ii) el nivel de expresión de diferentes miRNAs. Los miRNAs hsa-miR-100-5p y hsa-miR-30a-5p mostraron una expresión estable y ubicua, y su uso derivó en resultados con una calidad semejante a los conseguidos mediante la normalización por MCR. Por tanto, se sugirió esta combinación de miRNAs como la mejor opción para la normalización de futuros estudios singleplex qRT-PCR de miRNAs espermáticos.Por otro lado, se empleó RNA-seq, para caracterizar el transcriptoma espermático de individuos fértiles. Los resultados revelaron una red de mRNAs y lncRNAs en alto estado de fragmentación, pero que contenían un grupo de transcritos ubicuos. Los análisis de Ontología Génica de todos los mRNAs expresados mostraron una implicación en procesos de espermatogénesis y reproducción, la cual era más significativa en los análisis de los mRNAs altamente expresados, ubicuos y altamente estables. Aparte, los potenciales genes dianas en cis de los lncRNAs mostraron relación con procesos de desarrollo embrionario y adhesión celular, la cual prevalecía en los genes dianas que no estaban expresados en espermatozoides.Finalmente, el hecho de hallar transcritos ubicuos y de expresión correlacionada indicó un posible uso de estas moléculas como biomarcadores de fertilidad. Por tanto, se evaluó y se validó la presencia de pares de miRNAs espermáticos con una expresión correlacionada en individuos fértiles y no correlacionada en pacientes infértiles de diferentes etiologías (astenozoospermia, teratozoospermia, oligozoospermia e infertilidad inexplicable [UMI]). El par hsa-miR-942-5p/hsa-miR-1208 permitió clasificar correctamente el 85.71% de los casos de infertilidad, alcanzando el mayor potencial de diagnóstico de pacientes con alteraciones seminales. El par hsa-miR-34b-3p/hsa-miR-93-3p destacó por su potencial para discernir pacientes UMI. Aparte, varios pares de mRNAs y lncRNAs también mostraron expresiones correlacionadas en individuos fértiles, constituyendo unos candidatos potenciales para futuros estudios. |
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