Estudi funcional de la butanodiol deshidrogenasa (Bdh1p) de Saccharomyces cerevisiae. Aplicacions biotecnològiques a la indústria cervesera
La seqüenciació del genoma de Saccharomyces cerevisiae al 1996 va revelar que el 60% dels aproximadament 6000 gens del llevat codificaven per proteïnes de funció desconeguda. Donat que el nostre laboratori investiga l'estructura i funció d'enzims de la superfamíla de les deshidrogenases/re...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2004 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/3536 |
| Acceso en línea: | http://www.tdx.cat/TDX-0119106-170405 http://hdl.handle.net/10803/3536 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Cervesa Butanodiol Llevat Ciències Experimentals 577 |
| Sumario: | La seqüenciació del genoma de Saccharomyces cerevisiae al 1996 va revelar que el 60% dels aproximadament 6000 gens del llevat codificaven per proteïnes de funció desconeguda. Donat que el nostre laboratori investiga l'estructura i funció d'enzims de la superfamíla de les deshidrogenases/reductases de cadena mitja (MDR), vàrem realitzar una búsqueda en el genoma del llevat de possibles membres MDR encara no caracteritzats. Es van identificar 12 ORFs, dels quals 5 eren de funció desconeguda. La present tesi doctoral ha estudiat la funció de l'enzim codificat per un d'aquests gens, el YAL060W.<br/>S'ha clonat i expressat el gen YAL060W de S. cerevisiae per determinar l'activitat del seu producte gènic. El gen YAL060W, que s'ha anomenat BDH1, codifica per una butanodiol deshidrogenasa: la Bdh1p. Aquest enzim pertany a la superfamília enzimàtica de les MDR i és la primera butanodiol deshidrogenasa d'aquesta superfamília descrita en un organisme eucariòtic.<br/>Els principals substrats de l'enzim són l'acetoïna i el 2,3-butanodiol, i a més, és estereoespecífic pels isòmers d'aquests substrats en configuració R. Altres substrats de l'enzim són el diacetil i la 2,3-pentanodiona, a més de compostos amb grups diol, dicetona o hidroxicetona contigus. La Bdh1p és un enzim específic pel coenzim NAD(H). <br/>La Bdh1p s'expressa preferencialment a la fase estacionària quan s'esgota la glucosa del medi, així com quan es creix el llevat en fonts de carboni com l'etanol o la galactosa. <br/>S'ha identificat un altre enzim actiu amb diacetil i NADH en els homogenats de S. cerevisiae que ha resultat ser l'alcohol deshidrogenasa II (Adh2p). Aquest enzim és també actiu amb 2,3-pentanodiona, però no ho és amb acetoïna o 2,3-butanodiol. La reducció d'aquests compostos també és estereoespecífica però pels grups en configuració S.<br/>Durant la fermentació, S. cerevisiae produeix i acumula acetoïna i 2,3-butanodiol. La Bdh1p és la responsable de la producció de l'isòmer (2R,3R)-2,3-butanodiol. La deleció del gen BDH1 elimina l'acumulació d'aquest compost al medi així com l'activitat acetoïna reductasa en homogenats de llevat crescut en glucosa. Per tant, durant la fermentació alcohòlica la Bdh1p reduiria l'acetoïna sintetitzada a partir d'acetaldehid per la piruvat descarboxilasa, produint el 2,3-butanodiol. La Bdh1p seria l'enzim responsable d'aquesta branca secundària del metabolisme fermentatiu, que podria contribuir a regular el balanç redox de manera fina. <br/>En canvi la deleció dels gens ADH2 i YAL061W (amb un 51% d'identitat seqüencial amb el BDH1) no afecten al patró d'excreció del butanodiol, però es veu reduïda l'activitat diacetil reductasa en un 58% en fase exponencial i un 34% a la fase estacionària.<br/>Diacetil i 2,3-pentanodiona, també anomenats VDKs, són compostos organolèptics indesitjables que es produeixen durant la fabricació industrial de cervesa i que són eliminats durant un llarg període de maduració. Les VDKs són substrats de la Bdh1p, el que donava la possibilitat de que soques de llevat que sobreexpressessin la Bdh1p acceleressin l'eliminació d'aquests compostos i poguessin reduir el temps de maduració de la cervesa. Per això es va sobreexpressar la Bdh1p sota el control del promotor ADH1 en la soca industrial cervesera SID amb vectors centromèrics i multicòpia. Aquestes soques disminuïen, en certes condicions, l'acumulació de VDKs durant la fermentació del most. També es va modificar genèticament la mateixa soca industrial per tal de sobreexpressar la Bdh1p de manera estable, però la fermentació de most industrial amb aquesta soca modificada no va afectar els nivells d'acumulació de VDKs al medi. Les aplicacions biotecnològiques es varen estudiar amb la participació de l'empresa S.A. Damm. |
|---|