Desarrollo de procesos de producción de proteínas bioterapéuticas: Aumento de la productividad especifica en células HEK293
La tesis doctoral se basa en la producción de proteinas recombinantes bioterapéuticas mediante el cultivo de células de mamífero. El trabajo realizado ha consistido en la obtención de células de riñón embrionario humano (HEK293) modificadas genéticamente para producir dos proteinas bioterapéuticas c...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2018 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/650828 |
| Acceso en línea: | http://hdl.handle.net/10803/650828 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | HEK293 Biofàrmacs Biofármacos Biopharmaceuticals Edició genòmica Edición genómica Genome editing Ciències Experimentals 577 |
| Sumario: | La tesis doctoral se basa en la producción de proteinas recombinantes bioterapéuticas mediante el cultivo de células de mamífero. El trabajo realizado ha consistido en la obtención de células de riñón embrionario humano (HEK293) modificadas genéticamente para producir dos proteinas bioterapéuticas candidatas, el interferón gamma y el anticuerpo monoclonal trastuzumab. El objetivo principal del trabajo ha sido la mejora de las líneas celulares obtenidas, con el fin de aumentar la productividad especifica de las mismas. Durante el desarrollo del trabajo se han usado diversas aproximaciones para de conseguir este objetivo. Durante el capítulo 3 se ha realizado la construcción de las células productoras, comprobando que expresan los productos de interés y poniendo a punto las diversas técnicas necesarias para su cultivo. En el capítulo 4 se han evaluado diferentes elementos genéticos que regulan la expresión y la secreción de las proteinas recombinantes (Promotores y péptidos señal), encontrándose como elementos óptimos el promotor CMV y el péptido señal del interferón alfa-2. Con estos elementos se ha conseguido multiplicar por 5 la producción específica del anticuerpo monoclonal trastuzumab. En el capítulo 5, se ha explorado un elemento genético de gran importancia para la obtención de líneas celulares recombinantes, el marcador de selección basado en genes metabólicos. Estos marcadores son ampliamente usados en la industria biofarmacéutica, para seleccionar las células más productoras dentro de una población determinada sin necesidad de usar antibióticos para ello. Sin embargo, su aplicación en células HEK293 se ve dificultada por la expresión de enzimas endógenas que interfieren con los marcadores comercialmente disponibles. Los resultados obtenidos durante este capítulo han permitido la definición de dos marcadores de selección: La enzima fenilalanina hidroxilasa, aplicable a las células HEK293 no modificadas y la glutamina sintetasa, aplicada a células HEK293 mutantes obtenidas mediante CRISPR/Cas9. El uso de este último marcador, en combinación con un inhibidor, ha permitido una mejora de entre 3 y 5 veces en la producción de interferón gamma y de trastuzumab, en comparación con el marcador basado en antibióticos. En el capítulo 6 se ha explorado y desarrollado un método para integrar en el genoma de la célula HEK293, de forma dirigida, el vector que contienen el gen que codifica para las proteinas de interés. Para ello, se ha construido y caracterizado un sitio genómico de alta transcripción mediante el uso de la proteína verde fluorescente (eGFP), para, posteriormente, integrar en dicho lugar el transgen usando el sistema CRISPR/Cas9. Los resultados obtenidos demuestran que la técnica ensayada permite la integración dirigida en el punto deseado del ADN genómico de la célula, habiéndose logrado duplicar la producción especifica de interferón gamma y aumentando la producción de trastuzumab en un 30%. Finalmente, durante el capítulo 7 se ha llevado a cabo un estudio de escalado en la producción de interferón gamma usando biorreactores como paso previo a una potencial aplicación industrial. Se ha realizado un análisis de las condiciones fisiológicas de cultivo en biorreactor, habiendo sido necesario optimizar la concentración de CO2 y el pH con el fin de conseguir un proceso escalable desde el cultivo en matraz hasta el biorreactor y demostrando que las células HEK293 cultivadas en biorreactor necesitan una mínima cantidad de CO2 para conseguir un metabolismo optimo y mantener la productividad especifica. El proceso resultante ha sido escalado usando un reactor preindustrial de un solo uso de 50L. Se puede concluir, a tenor de los resultados obtenidos y, dada la variedad de modelos ensayados, que las técnicas desarrolladas resultan interesantes de cara a una posible aplicación en la producción de diferentes proteinas recombinantes de interés bioterapéutico, sector de gran importancia económica e industrial. |
|---|