Evolution of the Human Immunodeficiency Virus type I Protease and Integrase: Effects on Viral Replication Capacity and Robustness
La ràpida propagació del virus de la immunodeficiència humana tipus 1 (VIH-1) ha estat acompanyada d’una continua i extensa diversificació genètica vírica. Se sap poc sobre com la diversificació viral està influenciant la capacitat replicativa (CR) viral al llarg del temps. L’objectiu d’aquesta tesi...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2013 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/130015 |
| Acceso en línea: | http://hdl.handle.net/10803/130015 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Evolution Viral replication capacity Robustness Ciències Experimentals 578 |
| Sumario: | La ràpida propagació del virus de la immunodeficiència humana tipus 1 (VIH-1) ha estat acompanyada d’una continua i extensa diversificació genètica vírica. Se sap poc sobre com la diversificació viral està influenciant la capacitat replicativa (CR) viral al llarg del temps. L’objectiu d’aquesta tesi va ser investigar l’impacte de la diversificació del VIH-1 sobre la seva CR. Es van analitzar dos enzims vírics essencials, la proteasa (PR) i la integrasa (IN) del VIH-1, responsables de la maduració del virió emergent i de la persistència de l’ADN víric a la cèl·lula hoste respectivament. A més, es va investigar la robustesa mutacional de la PR del VIH-1, comparant la tolerància a mutacions aleatòries úniques d’una PR del VIH-1 generada artificialment in vitro amb la PR salvatge. Primerament, es va comparar la variabilitat genètica de cent trenta-nou PR, quaranta gag i quaranta-set IN del VIH-1 procedents d’aïllats clínics naïve primerencs amb cinquanta PR, quaranta-una gag i quaranta-set IN del VIH-1 procedents d’aïllats naïve tardans obtinguts 15 anys després. A continuació, trenta-tres seqüències de la PR del VIH-1 van ser amplificades a partir de tres grups de virus: dos grups de mostres naïve aïllades amb 15 anys de diferència i un tercer grup de mostres resistents a inhibidors de PR (IP). Les PR amplificades van ser recombinades amb un clon infecciós HXB2 i la seva CR va ser determinada en cèl·lules MT4. La CR també va ser mesurada en aquests tres grups després d’haver aplicat una mutagènesi aleatòria in vitro mitjançant una PCR propensa a errors. No es van observar diferències significatives en les CR dels diferents virus recombinants tant dels aïllats naïve primerencs com tardans (P=0.5729), tot i que les PR dels aïllats tardans tenien una conservació de seqüència significativament inferior a la dels aïllats primerencs (P<0.0001). Els virus recombinants mutats aleatòriament dels tres grups mostraren una CR significativament inferior als virus salvatges corresponents (P<0.0001). No hi havia una diferència significativa en la reducció de la infectivitat viral entre els virus portadors de les PR naïve mutades aleatòriament i les mostres aïllades primer o després (P=0.8035). Notablement, es va observar una pèrdua significativament més gran de la CR en el grup de les PR resistents a IP (P=0.0400). Aquests resultats demostren que la diversificació de la seqüència de la PR no ha afectat la CR del VIH-1 o la robustesa de la PR i indiquen que les PR portadores de substitucions de resistència a IP són menys robustes que les PR naïve. Posteriorment, es van amplificar quaranta-set seqüències de la IN del VIH-1 a partir de dos grups de virus provinents de pacients naïve aïllats amb 15 anys de diferència. Les IN amplificades van ser recombinades amb un clon infecciós pNL4-3 i la CR va ser determinada amb cèl·lules CEM-GFP, un sistema reporter de GFP determinat per tat. Es van observar diferències significatives en la CR tant dels virus recombinants dels aïllats primerencs com dels aïllats tardans (P=0.0286), tot i que les IN dels aïllats tardans tenien una conservació de seqüència significativament inferior respecte a una seqüència ancestral de subtipus B (P<0.0001). Aquests resultats suggereixen que la diversificació genètica de la IN al llarg del temps ha influenciat en alguns casos la CR viral ex vivo. Remarcablement, es va trobar que alguns polimorfismes S17N, I72V, S119P, i D256E estaven relacionats amb una reducció de la CR viral i el seu efecte additiu podria perjudicar la funció de la IN. Finalment, es va avaluar l’evolució artificial de la PR del VIH-1. Es va demostrar que la PR salvatge del VIH-1 és tant vulnerable a l’addició de mutacions úniques aleatòries com una PR artificial del VIH-1 generada in vitro. |
|---|