Study of natural nanovesicles carrying olfactory receptors for the development of biosensing platforms
[cat]Vesícules naturals produïes a partir de cèl·lules modificades genèticament són prometedors components de sensat per utilitzar com a detectors en biodispositius. Això és particularment cert en el cas de receptors adjuntats a proteïna G (GPCRs) presents en molts processos cel·lulars, on la seva f...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2015 |
| País: | España |
| Institución: | Universidad de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de la UB |
| OAI Identifier: | oai:diposit.ub.edu:2445/63346 |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/2445/63346 http://hdl.handle.net/10803/286002 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Electrònica Nanoestructures Olfacte Electronics Biosensors Nanostructures Smell |
| Sumario: | [cat]Vesícules naturals produïes a partir de cèl·lules modificades genèticament són prometedors components de sensat per utilitzar com a detectors en biodispositius. Això és particularment cert en el cas de receptors adjuntats a proteïna G (GPCRs) presents en molts processos cel·lulars, on la seva funcionalitat depèn estrictament del seu entorn lipídic. Els receptors de membrana estan involucrats en una gran varietat de vies bioquímiques i per tant són objectiu d’estudi per teràpia i desenvolupament de nous fàrmacs. Per tant, plataformes bioanalítiques i assajos d’unió receptor-lligand, utilitzant receptors transmembrana, requereixen la construcció de matrius de membranes lipídiques ben caracteritzades, actuant com a suport per evitar la desnaturalització de proteïnes durant el processament del bioxip. En aquesta tesi es presenta la producció i caracterització de nanovesícules de membrana (NV) provinents de cèl·lules de llevat Saccharomyces cerevisiae que contenen receptors olfactius (un membre de la família de GPCRs) heteròlogament expressats a la membrana. Hem demostrat que les fraccions de membrana, a partir de cèl·lules de llevat, en solució formen espontàniament nanovesícules esfèriques tancades. També s’ha demostrat, que després d’un procés de enginyeria genètica els receptors olfactius van ser expressats correctament a la membrana del llevat. També s’ha presentat un mètode simple per homogeneïtzar la mida de les nanovesícules. A més a més, es presenta per primer cop un nou mètode immunoquímic per la quantificació directa de les proteïnes transmembrana (GPCR) en el seu ambient lipídic natural. El mètode utilitza anticossos monoclonals en un assaig basat en ELISA amb alta detectabilitat. L’aplicació del mètode es demostra a través de la quantificació del receptors olfactius OR1740 i OR7D4 expressats en nanovesícules de membrana plasmàtica. També es presenta, mitjançant observació directa amb AFM, com les nanovesícules es depositen i s’aplanen sense trencar-se sobre substrats de vidre i or seguint la llei de difusió. Es demostra com en el cas del vidre els màxims recobriments superficials obtinguts són del 20-25% i en el cas del or funcionalitzat del 10-15%, controlant la concentració de nanovesícules, el temps de depòsit, la presència de residus procedents del procés de producció de les nanovesícules, la química de la superfície, la força iònica del medi, etc. Finalment, s’ha demostrat per SPR que els receptors expressats eren funcionals i que aquesta tècnica òptica permet la detecció de petites molècules, com són els odorants, a les concentracions en el rang micromolar. Els resultats presentats en aquesta tesis contribueixen donant un pas important a la realització de dispositius biosensors basats en nanovesícules naturals que integren receptors de membrana adjuntats a proteïna G. |
|---|