Molecular mechanisms of centromere inheritance in Xenopus egg extract

Tesis doctoral inédita, leída en Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 29/10/2013

Detalles Bibliográficos
Autor: Krizaic, Iva
Tipo de recurso: tesis doctoral
Fecha de publicación:2013
País:España
Institución:Universidad Autónoma de Madrid
Repositorio:Biblos-e Archivo. Repositorio Institucional de la UAM
Idioma:inglés
OAI Identifier:oai:repositorio.uam.es:10486/660487
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/10486/660487
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Biología molecular - Tesis doctorales
Cromosomas - Tesis doctorales
Biología y Biomedicina / Biología
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spelling Molecular mechanisms of centromere inheritance in Xenopus egg extractKrizaic, IvaBiología molecular - Tesis doctoralesCromosomas - Tesis doctoralesBiología y Biomedicina / BiologíaTesis doctoral inédita, leída en Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 29/10/2013The centromere is a specialized chromosomal region that provides the foundation for the assembly of the kinetochore, a macromolecular assembly that orchestrates chromosome segregation. In most organisms, centromeres are defined epigenetically by the presence of a histone H3 variant called Centromere Protein A (CENP-A). A group of sixteen proteins that co-immunoprecipitate with CENP-A and localize to centromeres, the Constitutive Centromere Associated Network or CCAN, participate in kinetochore assembly and function. Among them, CENP-C, CENP-T and CENP-W appear to be closest to CENP-A. The propagation and maintenance of this epigenetic mark from one generation to the next is essential for cell division. In this thesis we have used the Xenopus laevis egg cell-free system to explore these processes in molecular detail. Chromosomes assembled in vitro in these extracts build functional kinetochores and recapitulate most aspects of the CENP-A deposition process described for human cells. Using a combination of biochemistry and fluorescence microscopy we have dissected the contributions of CCAN proteins CENP-C, CENP-T and CENP-W to CENP-A deposition and kinetochore assembly. We found that CENP-C, CENP-T and CENP-W are recruited to centromeres at different times although the three of them are essential for full kinetochore assembly in mitosis. We also established that CENP-C is required for CENP-A loading whereas CENP-T and CENP-W are not. Biochemical characterization of these proteins in the soluble egg extract revealed known and novel interactions among the three proteins and with additional factors. In particular, CENP-C associates with CENP-W and at least three other proteins, HJURP, the CENP-A chaperone; M18BP1, a member of the Mis18 complex, and the chromatin remodeler FACT. While HJURP and M18BP1 had been previously shown to be essential for CENP-A deposition, we demonstrate here that FACT can be detected at centromeres in mitosis and is required for the loading of new CENP-A. We speculate that CENP-C is stored in the egg extract forming a macromolecular complex with many of the proteins implicated in CENP-A assembly in order to facilitate their recruitment to centromeres in the rapid embryonic cycles that follow fertilization.El centrómero es el locus cromosómico en el que se construye el cinetocoro, una estructura multiproteica que media la interacción entre los cromosomas y los microtúbulos del huso y que orquesta la segregación cromosómica. En la mayor parte de los organismos, los centrómeros están definidos epigenéticamente por la presencia de una variante de la histona H3 que se denomina CENP-A (de Centromere Protein A). Se ha descrito un grupo de dieciséis proteínas centroméricas que interaccionan con CENP-A, que reciben el nombre de CCAN (por Constitutive Centromere Associated Network), que son importantes para el correcto ensamblaje y funcionamiento del cinetocoro. Dentro de este grupo, CENP-C, CENP-T y CENP-W parecen estar más próximas a CENP-A. El mantenimiento de la marca epigenética del centrómero de una generación a la siguiente es crucial para una correcta segregación cromosómica. Con el objetivo de entender los mecanismos que regulan la incorporación de CENP-A a la cromatina centromérica y la formación del cinetocoro hemos empleado un sistema in vitro basado en extractos obtenidos de huevos de Xenopus laevis en los que es posible ensamblar cromosomas con cinetocoros funcionales. Mediante técnicas bioquímicas y microscopía de fluorescencia, en este trabajo nos hemos preguntado acerca de la interacción entre CENP-C, CENP-T y CENPW, su dinámica de asociación a cromatina, su contribución a la formación del cinetocoro y a la incorporación de nuevos nucleosomas CENP-A que ocurre en cada ciclo celular. Hemos observado que estas tres proteínas se localizan en el centrómero de los cromosomas obtenidos in vitro en distintos momentos del ciclo celular si bien las tres son esenciales para la formación del cinetocoro en mitosis. En tanto que CENP-C se requiere para la incorporación de CENPA, no es ese el caso de CENP-T y CENP-W. Curiosamente, CENP-C aparece en el extracto soluble asociada a HJURP, M18BP1 y el complejo remodelador de cromatina FACT. Estudios anteriores habían descrito el papel de HJURP y M18BP1 en la incorporación de CENP-A. Aquí demostramos por primera vez que FACT juega un papel fundamental en dicha incorporación, al menos en nuestro sistema experimental. Así pues, es posible que CENP-C se almacene en el citoplasma de los oocitos asociado a los principales factores encargados del ensamblaje de cromatina centromérica para guiarlos hacia el centrómero y facilitar este proceso en los primeros ciclos celulares que tienen lugar tras la fertilización.Losada, AnaDepartamento de Biología MolecularFacultad de Ciencias20132013-10-29doctoral thesishttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06NAhttp://purl.org/coar/version/c_be7fb7dd8ff6fe43info:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10486/660487reponame:Biblos-e Archivo. Repositorio Institucional de la UAMinstname:Universidad Autónoma de MadridInglésengopen accesshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2info:eu-repo/semantics/openAccessoai:repositorio.uam.es:10486/6604872026-06-23T12:46:27Z
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