| Sumario: | La aparición de organismos multicelulares supuso una de las mayores transiciones durante el curso de la evolución biológica temprana, habiendo surgido la multicelularidad de manera independiente en los tres dominios de la vida. Las cianobacterias son un amplio grupo monofilético de procariotas fotosintéticos con representantes unicelulares y multicelulares. Muchas cianobacterias filamentosas experimentan procesos de diferenciación celular dando lugar a células o grupos de células con funciones especializadas como son la fijación de nitrógeno, la supervivencia a condiciones adversas y la dispersión. La cianobacteria formadora de heterocistos Anabaena sp. PCC 7120 representa un sistema modelo para estudiar la multicelularidad, la diferenciación cellular y la fijación de nitrógeno. Anabaena crece formando cadenas de células, conocidas como tricomas o filamentos. En ausencia de una fuente de nitrógeno combinado, estos filamentos están formados por dos tipos celulares: células vegetativas que llevan a cabo la fotosíntesis oxigénica y heterocistos que fijan el nitrogeno atmosférico. Las células vegetativas transfieren carbono reducido a los heterocistos, y éstos transfieren nitrógeno a las células vegetativas. La transferencia intercelular de diferentes compuestos es un aspecto muy relevante de la biología de Anabaena que ha sido abordado en esta tesis. Dos vías distintas han sido consideradas para explicar la transferencia de nutrientes y reguladores entre las células del filamento durante la diferenciación de los heterocistos y el crecimiento diazotrófico en estas cianobacterias: una vía indirecta a través del periplasma del filamento y una directa a través de los complejos proteicos llamados “nexos septales” (“septal junctions”). La transferencia molecular intercelular en las cianobacterias filamentosas se ha estudiado con la técnica de análisis Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) usando diferentes marcadores fluorescentes: calceína, 5- carboxifluoresceína (5-CF) y esculina, que es un análogo a la sacarosa. En el Capítulo 1, analizamos la dependencia de la temperatura de la transferencia intercelular y concluimos que presenta propiedades de difusión simple. Esta observación es consistente con la presencia de nexos septales responsables de la comunicación intercelular. SepJ, FraC y FraD son proteínas septales identificadas como posibles componentes de los nexos septales, los cuales concluimos que permiten la transferencia intercelular de sustancias por difusión simple. Los nexos septales pueden ser considerados análogos a los conexones de las “gap junctions” de metazoos. Como ha sido mencionado anteriormente, la esculina (análogo fluorescente e la sacarosa) se ha usado para estudiar la transferencia molecular intercelular. En el “Experimental Preamble”, describimos un ensayo que puede ser usado para estudiar la incorporación de esculina a las células de Anabaena. Con este ensayo hemos definido que los transportadores que incorporan esculina en Anabaena son transportadores de α-glucósidos, ya que la incorporación de esculina es inhibida por α- glucósidos como la sacarosa y la maltosa. Los Capítulos 2 y 3 describen la identificación de componentes de transportadores de glucósidos del tipo ABC. Estos componentes son GlsC y GlsD (“nucleotide-binding domain proteins” [NBDs]), GlsP and GlsQ (“transmembrane domain proteins” [TMDs]), y GlsR (“solute-binding protein” [SBP]). Además, HepP, una proteína de la familia MFS, previamente descrita, también contribuye a la incorporación de esculina especialmente en condiciones diazotróficas. Anabaena ha sido considerada un organismo fototrófico estricto durante mucho tiempo. Sin embargo, aunque esta cianobacteria no tiene ningún gen que codifique de forma evidente un transportador de fructosa, trabajos recientes han indicado que puede crecer heterotróficamente con una concentración relativamente alta de fructosa (≥ 50 mM). En el Capítulo 3, describimos el crecimiento fototrófico estimulado por sacarosa, fructosa y glucosa en Anabaena, mostrando la capacidad de crecimiento mixotrófico de este organismo usando estos azúcares. Con objeto de averiguar si los componentes de los transportadores de glucósidos del tipo ABC que hemos identificado están relacionados con el crecimiento estimulado por azúcares, estudiamos el crecimiento mixotrófico en sus mutantes. Mientras que los mutantes glsC y glsD estaban drásticamente afectados en el crecimiento estimulado por sacarosa, los mutantes glsP, glsQ y glsR estaban afectados a menor nivel. Todos los mutantes también estaban afectados de alguna manera en el crecimiento estimulado por fructosa y glucosa, lo cual sugiere que estos azúcares pueden ser asimilados al menos en parte con el concurso de los transportador(es) de glucósidos. El genoma de Anabaena contiene 12 genes que codifican componentes de transportadores de glucósidos tipo ABC: cuatro SBPs, seis TMDs and dos NBDs. Esta información junto con nuestros resultados sugieren la presencia de al menos tres transportadores de glucósidos en Anabaena, uno de los cuales estaría formado por GlsR (SBP), GlsPGlsQ (TMDs) y GlsC-GlsD (NBDs). Otras SBPs podrían contribuir al funcionamiento de este transportador, y las proteínas NBD (GlsC y GlsD) parecen ser compartidas por los tres transportadores como ocurre en otros sistemas ABC. El análisis llevado a cabo mediante Bacterial Adenylate Cyclase Two Hybrid (BACTH) ha mostrado interacciones proteína-proteína consistentes con el modelo propuesto. El efecto de la inactivación de algunos de los genes gls en el crecimiento diazotrófico de Anabaena sugirió la posibilidad de una limitada transferencia de sacarosa a los heterocistos en algunos de estos mutantes. Los mutantes glsC, glsP y hepP estaban afectados en la transferencia intercelular de esculina, por lo que extendimos el estudio a la transferencia de calceína y 5-CF en todos los mutantes gls, así como al mutante hepP. Todos los mutantes ensayados estaban afectados, en particular, en la transferencia intercelular de calceína, lo cual recuerda al fenotipo de la mutación sepJ. Como ya hemos mencionado, SepJ es un posible componente de los nexos septales, y en este trabajo, mediante análisis BACTH, hemos visto que GlsP, GlsQ y HepP interaccionan con SepJ, lo cual sugiere que GlsP, GlsQ and HepP interaccionen con SepJ para un correcto funcionamiento de los nexos septales. Por otro lado, GlsC influye en la localización de SepJ y en el número de nanoporos formados en los discos septales de peptidoglicano. Estos resultados sugieren un papel específico de GlsC influyendo en la maduración de los nexos septales. En conclusión, la cianobacteria formadora de heterocistos Anabaena sp. PCC 7120 expresa transportadores ABC de glucósidos que contribuyen a la asimilación de azúcares haciendo posible un crecimiento mixotrófico. Además, los transportadores de glucósidos estudiados influyen en la comunicación intercelular mediada por los nexos septales.
|
|---|
