Structural and functional characterization of regulatory metallocarboxypeptidases
Las metalocarboxipeptidasas (MCPs) son enzimas zinc-dependientes que hidrolizan amino ácidos del extremo C terminal en proteínas y péptidos. La primera MCP en ser identificada fue la carboxipeptidasa A1 (CPA1), una enzima pancreática que hidroliza residuos C terminales hidrofóbicos. En las décadas s...
| Autores: | , |
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| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2015 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglés |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:148771 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/148771 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Carboxipeptidases Enzims |
| Sumario: | Las metalocarboxipeptidasas (MCPs) son enzimas zinc-dependientes que hidrolizan amino ácidos del extremo C terminal en proteínas y péptidos. La primera MCP en ser identificada fue la carboxipeptidasa A1 (CPA1), una enzima pancreática que hidroliza residuos C terminales hidrofóbicos. En las décadas siguientes después del descubrimiento de la CPA1, docenas de MCPs adicionales han sido descritas en diferentes tejidos y fluidos extrapancreaticos, comprendiendo un amplio rango de funciones fisiológicas que van desde la digestión de los alimentos hasta la producción de neuropéptidos y hormonas peptídicas o el procesamiento selectivo de la tubulina. La presente tesis tiene como objeto profundizar en el conocimiento de la estructura y función biológica de dos MCPs reguladoras. Para este propósito, se aplicaron un amplio espectro de aproximaciones bioquímicas con el fin de elucidar la actividad biológica de las carboxipeptidasas D y Z humanas. Además, se decidió estudiar por primera vez la estructura y funciones de los dominios tipo transtiretina (TTL) que se encuentran en todos los miembros de esta subfamilia de proteasas, escogiéndose como ejemplo el primer dominio TTL perteneciente al primer dominio catalítico de la carboxipeptidasa D humana (denominada en este trabajo como h-TTL). En el primer capítulo se describe la formación de estructuras amiloides bajo condiciones fisiológicas por el dominio h-TTL, y se descubre que el motivo de plegamiento transtiretina monomérico tiene una propensión inherente a agregar, dada la presencia de elementos estructurales amiloidogénicos preformados. El mecanismo de agregación que se describe en este trabajo para una proteína nativa monomérica tipo transtiretina, también se ha encontrado en diversas proteínas globulares, inicialmente solubles y asociadas con enfermedades conformacionales que se generan por la deposición de agregados, pudiendo ser un hecho genérico para motivos de plegamiento que muestren elementos amiloidogenicos preformados en sus estructuras, esencialmente hojas β. El segundo capítulo muestra la estructura cristalográfica resuelta a súper alta resolución de la h-TTL descrita en el primer capítulo. La información derivada del presente estudio podría facilitar el conocimiento del papel biológico de los dominios TTL encontrados en todos los miembros de la subfamilia M14B, pudiendo ser utilizada como una herramienta interesante para analizar en detalle las propiedades estructurales y los mecanismos de plegamiento de estos dominios. El tercer capítulo comprende la caracterización de la especificidad de sustrato de la carboxipeptidasa D humana, utilizando una combinación de diferentes aproximaciones peptidómicas cuantitativas. Esta enzima única con múltiples centros catalíticos, podría estar implicada en el procesamiento de neuropéptidos y factores de crecimiento. Por lo tanto, el estudio de su mecanismo de acción es de especial relevancia para el campo de la biomedicina. En el cuarto capítulo se describe el desarrollo de un método simple y barato para mejorar la producción proteica de carboxipeptidasas que presentan afinidad por heparina usando células de mamífero, cogiendo como ejemplo el caso de la carboxipeptidasa Z. La proteína purificada mediante este sistema es enzimáticamente activa y puede ser utilizada para estudios estructurales y funcionales de alto rendimiento. En el último capítulo se utilizan diferentes aproximaciones peptidómicas cuantitativas para caracterizar la especificidad de sustrato de la carboxipeptidasa Z humana. Además, en este trabajo se presenta el modelado de su dominio catalítico, así como el de su dominio tipo frizzled, con el fin de analizar su papel en la vía señalización de Wnt |
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