Oxidoreductive bioprocess intensification through reaction engineering and enzyme immobilization
La investigació plasmada en aquesta tesi doctoral tracta l'aplicació dels principis d'enginyeria de reacció i immobilització enzimàtica per a la millora de reaccions d'oxidoreducció biocatalitzades. En una primera part de la tesi, es va estudiar la co-immobilització de la monooxigenas...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2020 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglés |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:233678 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/233678 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Oxidoreductases Enzims Enzims immobilitzats |
| Sumario: | La investigació plasmada en aquesta tesi doctoral tracta l'aplicació dels principis d'enginyeria de reacció i immobilització enzimàtica per a la millora de reaccions d'oxidoreducció biocatalitzades. En una primera part de la tesi, es va estudiar la co-immobilització de la monooxigenasa P450 BM3 juntament amb un enzim regenerador del cofactor NADPH, la glucosa deshidrogenasa (GDH-Tac). Els millors derivats es van obtenir utilitzant dos suports d'agarosa, un funcionalitzat amb grups epoxy (83% i 20% activitats retingudes respectivament) i l'altre amb grups amino (28% i 25% activitats retingudes respectivament). Posteriorment es va provar de re-utilitzar aquests enzims immobilitzats en diferents cicles de reacció utilitzant un dels substrats naturals de la P450 BM3, el laurat de sodi. Un cop demostrat que ambdós enzims immobilitzats podien ser reciclats, es va estudiar l'aplicació d'aquests en dues reaccions d'interès industrial, la hidroxilació de la α-isoforona i la hidroxilació del diclofenac. En el primer cas, va fer falta optimitzar certs paràmetres de la reacció abans d'aplicar els derivats. Un cop es van tenir unes condicions acceptables, es va comprovar que els resultats obtinguts anteriorment amb el laurat de sodi, no podien ser extrapolats. La reutilització no va ser possible. En quant al diclofenac, es van obtenir resultats similars. En ambdós casos però, l'aplicació dels enzims en la seva forma soluble, va permetre obtenir conversions altes: 86.2% per a la α-isoforona (50 mM inicial) i 100% per al diclofenac (3.5 mM inicial). El producte hidroxilat de l'α-isoforona, la 4-hidroxi-isoforona, ha de ser oxidat en un segon pas per arribar a l'intermediari desitjat, la keto-isoforona. Aquesta segona reacció es duu a terme amb una alcohol deshidrogenasa, la qual també necessita un regenerador de cofactor, la NADPH oxidasa. Al aplicar els dos enzims en la seva forma soluble, al cap de 24h, es va aconseguir un 95.7% de rendiment i una productivitat de 6.52 g L-1 dia-1. A part, l'enzim diana, l'alcohol deshidrogenasa, es va poder immobilitzar en epoxy-agarosa obtenint una activitat retinguda del 58.2%. Al intentar re-utilitzar-lo, es va poder operar durant 96h (4 cicles) millorant el rendiment del biocatalitzador fins a 2.5 vegades comparat amb la reacció en soluble. La reacció d'hidrogenació de la α-isoforona, per altre banda, resulta en la 3,3,5- trimetilciclohexanona, un substrat amb interès industrial per a l'obtenció de polímers. En aquest cas, es va utilitzar la Baeyer-Villiger ciclohexanona monooxigenasa juntament amb una glucosa deshidrogenasa comercial (GDH-01) per a realitzar la reacció d'inserció d'un àtom d'oxigen en l'anell de carbonis. Es van optimitzar diferents paràmetres de la reacció com la formulació del biocatalitzador, la velocitat d'adició de substrat i la quantitat d'enzim afegida. Un cop optimitzada la reacció es va escalar primer a 1 litre i finalment a 100 litres. En aquesta última reacció a escala pre-industrial, es va obtenir una conversió del 85%, una productivitat de 2.7 g L- 1 h-1 i un rendiment del biocatalitzador de 0.83 g g-1 cww. Finalment aquesta mateixa reacció es va realitzar utilitzant els enzims immobilitzats i reciclantos. Tant la ciclohexanona monooxigenasa com la glucosa deshidrogenasa (GDH-01) es van poder immobilitzar en agarosa funcionalitzada amb grups amino. En el primer cas es va obtenir una activitat retinguda del 62.4% (mètode obtingut de la bibliografia) i en el segon cas del 62.6%. En reacció, els dos enzims immobilitzats van ser utilitzats tant per separat com conjuntament. Al cap de sis cicles de reacció (132.5 mM de substrat inicial), es va assolir un rendiment de biocatalitzador 3.6 vegades superior per a la monooxigenasa i 1.9 vegades superior per a la GDH- 01 comparat amb la reacció en soluble. |
|---|