Producció d'un inhibidor del VIH-1 en plantes de tabac i d'arròs
[cat] La expressió en plantes transgèniques representa una alternativa interessant per a la producció de proteïnes d'interès terapèutic. Els baixos costos de producció a gran escala, la capacitat de modificació postraduccional dels vegetals y la seguretat biològica del producte final son alguns...
| Autor: | |
|---|---|
| Formato: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2006 |
| País: | España |
| Recursos: | Universidad de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de la UB |
| OAI Identifier: | oai:diposit.ub.edu:2445/36283 |
| Acesso em linha: | https://hdl.handle.net/2445/36283 http://www.tdx.cat/TDX-1121107-120110 http://hdl.handle.net/10803/1052 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palavra-chave: | Proteïnes Plantes Conreu de la tabaquera Arròs Inhibidors enzimàtics VIH (Virus) Proteins Plants Cultivation of tobacco Rice Enzyme inhibitors HIV (Viruses) |
| Resumo: | [cat] La expressió en plantes transgèniques representa una alternativa interessant per a la producció de proteïnes d'interès terapèutic. Els baixos costos de producció a gran escala, la capacitat de modificació postraduccional dels vegetals y la seguretat biològica del producte final son alguns del atractius d'aquest emergent sistema de producció. El T-20 es un nou fàrmac antiviral contra el VIH-1 que actua inhibint el procés d'entrada del virus dins la cèl·lula diana impedint que les membranes del virus i cèl·lula es fusionin. Actualment, la producció d'aquest pèptid de 36 aminoàcids es realitza per síntesis química en un procés extraordinàriament complex que condiciona el elevat preu del producte final. En aquest treball s'ha adoptat una estratègia per acumular el T-20 a plantes consistent en la seva expressió mitjançant una fusió amb diferents dominis rics en prolina de gamma-zeïna, proteïna de reserva de 27 kDa del blat de moro. Anteriors estudis han demostrat que aquests dominis tenen la capacitat de quedar retinguts dins el reticle endoplàsmic y induir la formació de cossos proteics en plantes transgèniques de tabac. S'ha utilitzat dos espècies vegetals, tabac i arròs, per tal de testar el nivell d'acumulació del T-20 en fusió en diferents teixits. En plantes de tabac s'ha escollit una expressió constitutiva mitjançant el promotor 35S per acumular a fulla el T-20 fusionat amb quatre seqüències riques en prolina diferents (Rx3, R3, P4 i X10), Els resultats han demostrat que, tant per transformació estable com transitòria, la fusió Rx3-T20, que conté tota la regió N-terminal de la gamma-zeïna, és la que s'acumula millor en fulles de tabac. A demés, en una línia transgènica s'ha comprovat que aquesta proteïna de fusió no només es estable enfront la dessecació de la fulla, sinó que la seva expressió s'activa durant aquest procés degut segurament al lloc d'inserció dins el genoma de la planta. També s'han obtingut línies transgèniques d'arròs per tal d'acumular el T-20 específicament a gra, beneficiant d'aquesta forma l'estabilitat y emmagatzemament del fàrmac. Després de comprovar que el promotor de la gamma-zeïna era actiu però no específic en plantes transgèniques d'arròs, es va optar per la utilització d'un promotor endogen, RP5, per tal d'expressar la proteïna de fusió Rx3-T20 específicament a gra d'arròs. Es van assolir alts nivells d'acumulació específica a gra, comparables amb els generats amb un promotor constitutiu 35S. Tant a tabac com a arròs es van portar a terme experiments de fraccionament subcel·lular mitjançant gradients de sacarosa que van mostrar que les proteïnes de fusió s'acumulaven en una fracció densa on sedimenten els cossos proteics de blat de moro. A demés, mitjançant inmunolocalització al microscopi confocal s'ha pogut visualitzar l'acumulació de la proteïna de fusió Rx3-T20 en fulles de tabac en unes estructures esfèriques compatibles amb cossos proteics. En arròs, la localització sota el microscopi electrònic ens ha demostrar l'acumulació d'aquesta proteïna dins els cossos proteics de tipus I naturals de l'arròs. Amb l'objectiu de demostrar que el sistema l'expressió en plantes permetia obtenir el fàrmac T-20 actiu es va desenvolupar un procés de purificació a partir de fulles de tabac consistent en una precipitació amb sulfat d'amoni, cromatografia de bescanvi aniònic, digestió amb proteasa y purificació per HPLC. Es va demostrar que el producte final corresponia per espectrometria de masses al T-20 y que, mitjançant experiments en cultiu cel·lular, presentava la mateixa activitat antiviral que el T-20 produït per síntesis química. D'aquesta manera es conclou que l'expressió en plantes transgèniques representa un sistema de producció de T-20 alternatiu a la síntesis química. |
|---|