Structural and Functional Studies on Proteinaceous Metallocarboxypeptidase Inhibitors
La present tesi està formada per sis treballs de recerca independents que estan situats en el camp dels inhibidors de metal·locarboxipeptidases: s'estudia el seu plegament, estabilitat, estructura i funció. <br/>El primer treball inclou l'aïllament i el clonatge de l'ADNc d'...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2005 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/3531 |
| Acceso en línea: | http://www.tdx.cat/TDX-1026105-115001 http://hdl.handle.net/10803/3531 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Metallocarboxypeptidase Structure Folding Ciències Experimentals 573 |
| Sumario: | La present tesi està formada per sis treballs de recerca independents que estan situats en el camp dels inhibidors de metal·locarboxipeptidases: s'estudia el seu plegament, estabilitat, estructura i funció. <br/>El primer treball inclou l'aïllament i el clonatge de l'ADNc d'un nou inhibidor de carboxipeptidases de la paparra, anomenat TCI. Els estudis realitzats sobre la forma recombinant del TCI indiquen que aquesta proteïna està fortament limitada pels seus ponts disulfur, sent molt estable enfront un ampli rang de pH i altament resistent a condicions desnaturalitzants. El TCI recombinant és un inhibidor que s'uneix fortament a TAFIa, estimulant així la fibrinòlisi in vitro, fet que li confereix potencial en aplicacions de prevenció o tractament de desordres trombòtics.<br/>El segon treball presenta l'estructura cristal·lina del TCI unit a la carboxipeptidasa A bovina i a la carboxipeptidasa B humana. El TCI està format per dos dominis que són estructuralment molt semblants a pesar de tenir un baix grau d'homologia seqüencial. Cada domini inclou una hèlix a curta seguida per una petita fulla b antiparal·lela girada i presenta una alta homologia estructural enfront proteïnes de la família de les b-defensines. El TCI s'ancora a la superfície de les carboxipeptidases de mamífer en un mode d'unió doble que no s'havia observat abans per cap altre inhibidor de carboxipeptidases.<br/>En el tercer treball s'examina la contribució de cadascun dels aminoàcids del lloc d'unió secundari de l'inhibidor de carboxipeptidases de patata (PCI) de cara a les propietats generals d'aquesta proteïna. Els estudis estructurals i enzimàtics demostren que el posicionament correcte del lloc d'unió primari per una unió i inhibició eficient de la carboxipeptidasa A depèn significativament del lloc d'unió secundari. A més, l'estudi comparatiu del plegament oxidatiu d'una sèrie de mutants del PCI utilitzant una aproximació de captura dels ponts disulfur indiquen que les forces no covalents dirigeixen el replegament d'aquesta petita proteïna rica en ponts disulfur a l'etapa de "reshuffling", que és el pas limitant del procés de plegament del PCI.<br/>En el quart treball s'ha determinat els camins de plegament oxidatiu i desplegament reductor de l'inhibidor de carboxipeptidases de sangonera (LCI). L'LCI reduït i desnaturalitzat és replega ràpidament a través d'un flux seqüencial d'espècies amb un, dos, tres i quatre ponts disulfur fins assolir la forma nativa. Dins dels intermediaris de plegament de l'LCI hi trobem dues espècies predominants de tres ponts disulfur (anomenades III-A i III-B) i una població heterogènia d'isòmers "scrambled" (quatre ponts disulfur no natius) que s'acumulen consecutivament al llarg de la reacció de plegament. Aquest estudi revela que les formes III-A i III-B contenen exclusivament ponts disulfur natius i corresponen a espècies estables i parcialment estructurades que s'interconverteixen entre elles assolint l'equilibri abans que la formació dels isòmers "scrambled" tingui lloc. <br/>En el cinquè treball s'ha purificat l'intermediari III-A directament de la reacció de plegament i se l'ha caracteritzat estructuralment per RMN. Els resultats mostren que aquesta espècie presenta una estructura força nativa, tot i que li manquen alguns elements d'estructura secundària per la qual cosa és més flexible que l'LCI natiu. III-A representa el primer exemple d'un intermediari "disulfide insecure" ("ponts disulfur insegurs") determinat estructuralment. L'oxidació directa d'aquesta espècie cap a la proteïna totalment nativa sembla estar restringida per l'enterrament de les seves dues cisteïnes dins d'una estructura semblant a la nativa. També s'han utilitzat aproximacions teòriques basades en constriccions topològiques que prediuen força bé la presència d'aquest intermediari de plegament. <br/>L'últim treball d'aquesta tesi tracta sobre l'altre intermediari majoritari de plegament de l'LCI. En aquest treball s'ha construït i analitzat extensivament un anàleg d'aquest intermediari. Els resultats obtinguts mostren que aquesta proteïna presenta una estructura global i una activitat semblants a les de la forma salvatge de l'LCI. A més, presenta un procés de plegament més ràpid i eficient que l'LCI salvatge. Tanmateix, aquest anàleg està fortament desestabilitzat, fet que indica que el quart pont disulfur dóna alta estabilitat i especificitat estructural a l'LCI. |
|---|