Development of efficient eukaryotic and bacterial expression systems for functional studies of recombinant proteins of biomedical interest
Al llarg aquesta tesi s'han fet molts esforços per desenvolupar un sistema d'expressió heteròloga de glicoproteïnes humanes d'alt rendiment, puresa i homogeneïtat, així amb la flexibilitat necessària per modificar la proteïna a voluntat. Hem desenvolupat dos sistemes d'expressió...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de documento: | tese |
| Data de publicação: | 2020 |
| País: | España |
| Recursos: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositório: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglês |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:238226 |
| Acesso em linha: | https://ddd.uab.cat/record/238226 |
| Access Level: | Acceso aberto |
| Palavra-chave: | Cèl·lules eucariotes Proteïnes |
| Resumo: | Al llarg aquesta tesi s'han fet molts esforços per desenvolupar un sistema d'expressió heteròloga de glicoproteïnes humanes d'alt rendiment, puresa i homogeneïtat, així amb la flexibilitat necessària per modificar la proteïna a voluntat. Hem desenvolupat dos sistemes d'expressió a eucariotes, uno a cèllules de Drosophila Schneider 2, per a l'expressió inductible mitjançant l'addició de Cu2SO4 i per a l'expressió transitòria amb transfecció de polietilenimina (PEI); i un per a mamífer, un sistema d'expressió transitòria basat en cèl·lules Expi293F i transfecció de PEI. La proteòlisi és una part fonamental de la rotació de proteïnes en organismes vius i el seu desequilibri pot comportar malalties, provocant inflamacions, malalties neurodegeneratives, càncer o mort cel·lular entre altres trastorns. Per tant, els mecanismes que regulen l'activitat de la peptidasa s'han de regular de manera estricta per garantir l'activitat proteolítica adequada en el moment i lloc adequats. La queilis-isozima 1 de la subtilisina humana (hSKI1) és la proteïna serina que catalitza el primer pas a l'activació proteolítica de les proteïnes d'unió de l'element regulador d'esterol (SREBPs), regulador clau del metabolisme dels lípids intracel·lulars. Aquesta proteasa és una proteïna transmembrana localitzada al reticle endoplasmàtic i l'aparell de Golgi i la seva maduració és un procés molt complex. Vam aconseguir una expressió soluble als sistemes d'expressió d'insectes i mamífers i establim les bases per a futurs estudis bioquímics i estructurals amb garanties d'èxit. Al segon projecte, el principal inhibidor de la proteasa del plasma (la α2-macroglobulina humana, hα2M), que neutralitza un ampli espectre d'endopeptidases, però també modula l'activitat de les citocines, hormones, factors de creixement i altres proteïnes i, per tant, per tant té un gran impacte en la fisiologia humana. Es van realitzar assajos bioquímics, biofísics, estructurals i d'unió amb altres dianes interessants (Streptococcus GRAB, TGFβ2 humà i LRP1 humà) en complexos amb hα2M autèntics i recombinants per a caracteritzar aquestes interaccions. Per tant, també vam expressar les variants hα2M en cèl·lules eucariotes i vam purificar l'autèntica proteïna de la sang. A més, expressem pro-TGFβ2 a cèllules d'insecte i mamífer i cristalizamos la forma madura de TGFβ2. I finalment, vam revisar la literatura disponible sobre la família de les metaloproteinases de matriu (MMP) fora de vertebrats i vam realitzar cerques a la base de dades de dominis catalítics de MMP potencials en invertebrats, plantes, fongs, virus, protistes, arqueus i bacteris. En general, la present tesi ha establert nous i prometedors sistemes d'expressió al laboratori, que han beneficiat i ha contribuït substancialment al camp als nivells d'expressió, purificació i cristal·lització de la proteïna serina hSKI1 i l'inhibidor de la proteasa hα2M, sols o interactuant amb GRAB i TGFβ2. |
|---|