Bases estructurales de la señalización y regulación por nitrógeno y procesos asociados

Tesis doctoral, 218págs, 25 figuras.

Detalles Bibliográficos
Autor: Tremino-Agulló, Lorena
Tipo de recurso: tesis doctoral
Fecha de publicación:2019
País:España
Institución:Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)
Repositorio:DIGITAL.CSIC. Repositorio Institucional del CSIC
OAI Identifier:oai:digital.csic.es:10261/178665
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/10261/178665
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Estructura de proteínas
COG0325
Superfamilia PII
CutA
PLPBP
PLPHP
PROSC
Piridoxal fosfato (PLP)
Epilepsia dependiente de vitamina B6
Mutaciones hereditarias
Cobre
Termoestabilidad
Correlación estructura-función
Proteínas recombinantes
Mutagénesis dirigida
Synechococcus elongatus PCC7942
Cristalografía
Difracción de rayos X
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It studies and characterizes the non-canonical member of the PII protein superfamily named CutA, a highly conserved protein in all domains of life (including animals and humans) which is generally annotated as protecting against divalent metals. We examine the possible protection provided by CutA against metals, using knockouts for the CutA-encoding gene of two phylogenetically distant bacteria, Escherichia coli and Synechococcus elongatus PCC7942. Neither complementation studies in E. coli by the wild-type gene, nor observational studies of sensitivity to metals in the S. elongatus knockout have supported the function annotated for CutA, although we show by turbidimetric monitoring that Cu2+ causes aggregation of pure S. elongatus CutA (produced recombinantly) and therefore binds to it, although with a low affinity by comparison with the concentrations of this metal that are toxic for this cyanobacterium. Aiming at getting further insight into CutA, we have determined at very high resolution, by X-ray diffraction, the structure of this protein of S. elongatus, failing to observe Cu2+ bound in this structure, but showing that the three pockets formed at intersubunit boundaries in the CutA homotrimer are capable of transporting organic molecules (in our case Bis-Tris) without inducing conformational changes in the protein. This finding supports a possible function of CutA based on the binding to these pockets of neutral or positively charged biomolecules capable of forming several hydrogen bonds with the pocket walls, which are endowed with negative potential and have a strong polar character. We have also studied the PipY protein of S. elongatus, recently identified as a functional partner of the aforementioned PipX, determining its spectroscopic properties, binding of pyridoxal phosphate (PLP) and solving its structure by X-ray diffraction. We prove that PipY is monomeric and has PLP attached. Its structure does not favor an enzymatic role of PipY, being more appropriate for exerting a possible function in the homeostasis of PLP. Given the very recent description of a human vitamin B6-dependent genetic epilepsy associated to mutations in the human orthologue of the pipY gene, PROSC (now called PLPBP, encoding the PROSC protein, now named PLPHP), we used first S. elongatus PipY and afterwards and more extensively human PROSC to test by site-directed mutagenesis the pathogenicity of the mutations that have been associated with this epilepsy. These studies have demonstrated the pathogenicity and established mechanisms for this pathogenicity for each of the missense mutations reported thus far in patients with PROSC-associated epilepsy. Our studies represent an important advance in the understanding of PipY-like proteins and of epilepsy associated with the human form thereof.[ES] Enmarcada en la línea de investigación de nuestro laboratorio sobre señalización por nitrógeno principalmente en la cianobacteria Synechococcus elongatus PCC7942, con esfuerzos centrados en las proteínas PII y PipX y su red de señalización, esta Tesis amplía el espectro de moléculas investigadas en relación con dicha red. Estudia y caracteriza el miembro no canónico de la superfamilia de la proteína PII denominado CutA, generalmente anotado como de protección frente a metales divalentes, altamente conservado en todos los dominios de la vida (incluidos animales y el ser humano). En ella examinamos la posible protección frente a metales provista por CutA en dos bacterias muy distantes, Escherichia coli y Synechococcus elongatus, usando knockouts para ambas del gen que codifica para CutA. Ni los estudios de complementación en E. coli del gen silvestre ni los observacionales de sensibilidad a metales en S. elongatus han dado soporte a la función anotada para CutA, a pesar de que demostramos mediante seguimiento turbidimétrico que el Cu2+ hace agregar a la proteína CutA pura de S. elongatus (producida recombinantemente) y por tanto se une a ella, aunque con una afinidad baja por comparación con las concentraciones tóxicas de este metal para dicha cianobacteria. Buscando profundizar en el conocimiento de CutA, hemos determinado a muy alta resolución mediante difracción de rayos X la estructura de esta proteína de S. elongatus, sin evidenciar complejo alguno con cobre, pero demostrando que los tres bolsillos intersubunidades en el homotrímero de CutA son capaces de transportar moléculas orgánicas (en nuestro caso Bis-Tris). Estos resultados apoyan una posible función de CutA basada en la unión a estos bolsillos de biomoléculas neutras o positivamente cargadas y capaces de formar varios puentes de hidrógeno con las paredes de potencial negativo y fuerte carácter polar de estos bolsillos. También hemos estudiado la proteína PipY de S. elongatus, identificada recientemente como pareja funcional de la antes mencionada PipX, determinando sus propiedades espectroscópicas, unión de piridoxal fosfato (PLP) y resolviendo su estructura mediante difracción de rayos X. Probamos que PipY es monomérica y que tiene PLP unido. Su estructura no apoya que sea un enzima, siendo aparentemente apropiada para ejercer una posible función en la homeostasis de PLP. Dado que muy recientemente se ha descrito una epilepsia genética humana dependiente de vitamina B6 debida a mutaciones en el gen humano ortólogo de pipY, PROSC (ahora llamado PLPBP; codifica la proteína PLPHP), usamos inicialmente PipY de S. elongatus y luego PROSC humana como banco de pruebas de la patogenicidad de las mutaciones que se han asociado a esta epilepsia, utilizando para ello mutagénesis dirigida y producción de las formas silvestre y mutantes de estas proteínas, comparando sus propiedades. Estos estudios han demostrado la patogenicidad y establecido mecanismos para la misma para cada una de las mutaciones de cambio de sentido de PROSC descritas hasta ahora en esta epilepsia. Nuestros estudios han representado un importante avance en la comprensión de las proteínas de tipo PipY y de la epilepsia asociada a la forma humana de las mismas.Para la realización de esta Tesis, Lorena Tremiño Agulló ha disfrutado de una Beca de Formación de Personal Investigador (FPI) (BES-2012-058304) otorgado por el Ministerio de Economía, Industria y Competitividad. El trabajo se ha llevado a cabo en el grupo 739 del CIBERER-Instituto de Salud Carlos III (IP, V. Rubio) y se ha enmarcado dentro de los proyectos: - “Luz estructural sobre señalización y regulación por nitrógeno y sobre biosíntesis de arginina/urea, sus errores congénitos, y su conexión con biología del envejecimiento”, (BFU2011-30407) del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España (Investigador principal, V. Rubio). - “Una mirada molecular al control de la detoxificación de amonio y a sus patologías y errores congénitos, y a la señalización por amonio. En busca del papel de la proteína CutA”, (BFU2014-58229) del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España (Investigador principal, V. Rubio). - "BioMeder. Genes, proteínas y rutas de señalización en enfermedades raras" (PrometeoII/2014/029) de la Conselleria d'Educació de laPeer reviewedUniversidad Politécnica de ValenciaCSIC - Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV)Rubio, VicenteMinisterio de Economía, Industria y Competitividad (España)Ministerio de Economía y Competitividad (España)Generalitat ValencianaConsejo Superior de Investigaciones Científicas [https://ror.org/02gfc7t72]201920192019info:eu-repo/semantics/doctoralThesishttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06http://hdl.handle.net/10261/178665reponame:DIGITAL.CSIC. 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