Providing growth-decoupled strategies for recombinant protein production in Komagataella phaffii
Komagaella phaffii s'ha convertit en els últims anys en la factoria cel·lular de llevat preferida per a la producció de proteïnes recombinants i biomolècules. Per a desenvolupar un nou bioprocés es requereixen principalment dues fases: la generació de la soca heteròloga i la optimització del pr...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2024 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglés |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:305357 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/305357 |
| Access Level: | acceso embargado |
| Palabra clave: | Bioprocés Bioprocess Biproceso Pichia pastoris Proteïna recombinant Recombinant protein Proteína recombinante Ciències Experimentals |
| Sumario: | Komagaella phaffii s'ha convertit en els últims anys en la factoria cel·lular de llevat preferida per a la producció de proteïnes recombinants i biomolècules. Per a desenvolupar un nou bioprocés es requereixen principalment dues fases: la generació de la soca heteròloga i la optimització del procés de producció, també conegut com enginyeria de bioprocessos. No obstant, per ara només la primera etapa ha estat àmpliament estudiada en K. phaffii. En l'enginyeria de bioprocessos, és de vital importància que les condicions de cultiu s'adaptin al promotor seleccionat, que és qui dirigeix l'expressió de la proteïna recombinant. Per evitar l'ús de metanol i promoure una regulació més independent de la font de carboni, promotors alternatius desreprimits i/o desacoblats al creixement han guanyat molta rellevància últimament, com ara el promotor ortòleg PDF. Per tant, aquesta tesi s'ha centrat en la identificació de promotors desacoblats al creixement i lliures de metanol, així com en el desenvolupament d'estratègies de cultiu innovadores que exprimeixin al màxim el potencial del promotor. Com a objectiu final es trobava l'aplicació dels coneixements adquirits per tal de desenvolupar un bioprocés escalable per a la producció d'una peroxigenasa inespecífica (UPO, per les seves sigles en anglès). El promotor PDH es va identificar mitjançant l'anàlisi transcriptòmic de cultius en erlenmeyer en condicions de manca de repressió per font de carboni. A partir de cultius preliminars, es va observar que el promotor PDH es trobava altament activat en condicions de restricció severa de carboni. D'acord amb això, es va dissenyar una estratègia en bioreactor desacoblada al creixement, realitzant una primera fase de cultiu en fed-batch a una velocitat específica de creixement alta, amb l'objectiu d'aconseguir densitats cel·lulars mitjanes. A continuació, es va aplicar una restricció severa de la font de carboni a base de mantenir un cabal d'alimentació constant molt baix, obtenint les anomenades condicions de pseudo-fam. Tot i que la biomassa no va augmentar en aquesta segona fase, la producció de la lipasa B de Candida antarctica (CalB) va incrementar notablement, duplicant els nivells de CalB produïts per una soca basada en el clàssic promotor GAP. A causa de la rellevància de la regulació de PDH, es van dur a terme dues campanyes d'enginyeria de promotors per augmentar-ne la força. Com a resultat, MV1 i MV2 es van eregir com les millors variants per a l'expressió de CalB en cultius en erlenmeyer, gairebé doblant la producció de CalB en comparació amb la soca basada en PDH. Un cop enxamplat el nombre de promotors desacoblats al creixement disponibles per K. phaffii (PDH, MV1, MV2 i PDF), es van realitzar cultius en bioreactor empreant diferents estratègies d'alimentació amb glucosa, glicerol i metanol, estudiant com afecta la restricció de carboni a la producció de CalB. En tots els cultius, PDF va mostrar els nivells de producció més alts, a banda d'una millor robustesa i reproducibilitat, fet que el va convertir en el promotor seleccionat per a escalar a planta pilot el procés de producció d'una UPO. A més, l'anàlisi transcripcional de 26 gens va permetre la identificazció de 12 gens regulats positivament en condicions de pseudo-fam, suggerint que els seus promotors serien bons candidats per conduir l'expressió de proteïnes recombinants. Es va fer un canvi d'escala d'un factor de 100 vegades en la producció de la UPO d'Hypoxylon sp. EC38 (HspUPO), mantenint els mateixos nivells de producció que a escala laboratori, a més de dos processos de recuperació del producte. En total es van escalar exitosament dos processos amb diferents estratègies d'alimentació sense metanol, prèviament dissenyades al laboratori. La millor de les dues condicions va registrar la productivitat d'UPO més alta mai reportada. |
|---|