Estudio y caracterización de la nueva quinasa dependiente de calmodulina: CKK2
[spa] La familia de CaM quinasas (CAMK por sus siglas en inglés) son una familia de quinasas, dependientes del complejo Ca2+/CaM importantes por su implicación en diferentes funciones como la transcripción de genes, la supervivencia/muerte celular (apoptosis), la organización del citoesqueleto, el a...
| Autor: | |
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| Formato: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2015 |
| País: | España |
| Recursos: | Universidad de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de la UB |
| OAI Identifier: | oai:diposit.ub.edu:2445/102941 |
| Acesso em linha: | https://hdl.handle.net/2445/102941 http://hdl.handle.net/10803/396284 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palavra-chave: | Calmodulina Calci Citosquelet Calmodulin Calcium Cytoskeleton |
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Aligué i Alemany, Rosa Maria Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències |
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[spa] La familia de CaM quinasas (CAMK por sus siglas en inglés) son una familia de quinasas, dependientes del complejo Ca2+/CaM importantes por su implicación en diferentes funciones como la transcripción de genes, la supervivencia/muerte celular (apoptosis), la organización del citoesqueleto, el aprendizaje y la memoria (Swulius & Waxham, 2008). Se ha demostrado la funcionalidad de esta familia de quinasas al expresar la CAMKII humana en Schizosaccharomyces pombe produciendo un arresto del ciclo celular. Tambien se ha descrito en S. pombe una quinasa a homologa a la CAMKI de mamíferos funcional, la cual necesita para su activación la unión del complejo Ca2+/CaM y la fosforilación por una quinasa upstream. Nuestro grupo encontró que la fosforilación de Cmk1 en respuesta a Ca2+ desaparece al mutar la CAMKK, ckk2 (Cisneros-Barroso et al., 2014). En este trabajo planteamos como primer objetivo determinar si la fosforilación de Cmk1 es debida a la actividad de la quinasa Ckk2 de manera directa. Encontramos que fosforila a Cmk1 in vivo e in vitro, como su homóloga en mamíferos la CAMKK2, estableciendo una cascada de las CAMK en S. pombe. Encontramos también que Ckk2 es una quinasa dependiente del complejo Ca2+/CaM constituyéndose como una CAMK propiamente dicha. La viabilidad de un mutante nos puede indicar si el gen mutado esta implicado en la vía del estrés al que es sometido. Al evaluar el mutante Δckk2 encontramos que la deleción de ckk2 compromete la viabilidad celular frente agentes que modifican el citoesqueleto (tiabendazol, Latrunculina) y es resistente frente agentes que compromete la pared celular (calcofluor). Del mismo modo quisimos evaluar el mutante Δckk2 en condiciones de deprivación de nutrientes y encontramos que la deleción de ckk2 no afecta la viabilidad celular, a diferencia de Ssp1, otra CAMKK en S. pombe (Hanyu et al. 2009), sin embargo es importante para la citocinesis. Observamos un retraso en la citocinesis en condiciones de deprivación de glucosa reflejado en un aumento del índice de septación entre las 4 y 12 horas de deprivación, y en condiciones de deprivación de nitrógeno encontramos que el mutante Δckk2 presenta un alto índice de septación con respecto a la cepa salvaje (26% y 0% respectivamente); esto nos indicaría que Ckk2 probablemente esté implicada en algún proceso que dé lugar a la citocinesis. Addicionalmente, encontramos que la expresión de ckk2 aumenta tanto en condiciones de deprivación de glucosa como de nitrógeno, y este aumento se ve reflejado a nivel proteico. La proteína aumenta especialmente a partir de las 12 horas en deprivación, y además se observa una modificación pos-traduccional correspondiente a una sumoilación. Del análisis de la secuencia encontramos una lisina la K202, consenso de sumoilación (Beauclair et al. 2015; Zhao et al. 2014) y que se encuentra conservada en las CAMKK2, la homóloga en mamíferos de esta K202 está descrita como una lisina de ubiquitinación (Kim et al. 2011). Nosotros hemos estudiado la ubiqüitinizacón de nuestra proteína mediante anticuerpos pero no parece ubiquitinada. Por otra parte, tampoco está descrito que la CAMKK de mamíferos se encuentre sumoilada en alguna condición. Las modificaciones por sumo pueden alterar la actividad de una proteína, su localización, y/o estabilidad. En algunos casos sumo y ubiquitina tienen roles opuestos, donde la sumoilación protege la proteína de degradación ocupando la misma lisina para la ubiquitinación (Miteva et al. 2010). Es presumible pensar que en condiciones ricas de nutrientes Ckk2 sea diana de ubiquitina y se degrade, explicando los bajo niveles de la proteína en medio rico; y por el contrario en condiciones de deprivación de nutrientes, se favorezca su sumoilación para estabilizarla, en acorde con la acumulación de Ckk2 a lo largo del tiempo. |
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Nuestro grupo encontró que la fosforilación de Cmk1 en respuesta a Ca2+ desaparece al mutar la CAMKK, ckk2 (Cisneros-Barroso et al., 2014). En este trabajo planteamos como primer objetivo determinar si la fosforilación de Cmk1 es debida a la actividad de la quinasa Ckk2 de manera directa. Encontramos que fosforila a Cmk1 in vivo e in vitro, como su homóloga en mamíferos la CAMKK2, estableciendo una cascada de las CAMK en S. pombe. Encontramos también que Ckk2 es una quinasa dependiente del complejo Ca2+/CaM constituyéndose como una CAMK propiamente dicha. La viabilidad de un mutante nos puede indicar si el gen mutado esta implicado en la vía del estrés al que es sometido. Al evaluar el mutante Δckk2 encontramos que la deleción de ckk2 compromete la viabilidad celular frente agentes que modifican el citoesqueleto (tiabendazol, Latrunculina) y es resistente frente agentes que compromete la pared celular (calcofluor). Del mismo modo quisimos evaluar el mutante Δckk2 en condiciones de deprivación de nutrientes y encontramos que la deleción de ckk2 no afecta la viabilidad celular, a diferencia de Ssp1, otra CAMKK en S. pombe (Hanyu et al. 2009), sin embargo es importante para la citocinesis. Observamos un retraso en la citocinesis en condiciones de deprivación de glucosa reflejado en un aumento del índice de septación entre las 4 y 12 horas de deprivación, y en condiciones de deprivación de nitrógeno encontramos que el mutante Δckk2 presenta un alto índice de septación con respecto a la cepa salvaje (26% y 0% respectivamente); esto nos indicaría que Ckk2 probablemente esté implicada en algún proceso que dé lugar a la citocinesis. Addicionalmente, encontramos que la expresión de ckk2 aumenta tanto en condiciones de deprivación de glucosa como de nitrógeno, y este aumento se ve reflejado a nivel proteico. La proteína aumenta especialmente a partir de las 12 horas en deprivación, y además se observa una modificación pos-traduccional correspondiente a una sumoilación. Del análisis de la secuencia encontramos una lisina la K202, consenso de sumoilación (Beauclair et al. 2015; Zhao et al. 2014) y que se encuentra conservada en las CAMKK2, la homóloga en mamíferos de esta K202 está descrita como una lisina de ubiquitinación (Kim et al. 2011). Nosotros hemos estudiado la ubiqüitinizacón de nuestra proteína mediante anticuerpos pero no parece ubiquitinada. Por otra parte, tampoco está descrito que la CAMKK de mamíferos se encuentre sumoilada en alguna condición. Las modificaciones por sumo pueden alterar la actividad de una proteína, su localización, y/o estabilidad. En algunos casos sumo y ubiquitina tienen roles opuestos, donde la sumoilación protege la proteína de degradación ocupando la misma lisina para la ubiquitinación (Miteva et al. 2010). Es presumible pensar que en condiciones ricas de nutrientes Ckk2 sea diana de ubiquitina y se degrade, explicando los bajo niveles de la proteína en medio rico; y por el contrario en condiciones de deprivación de nutrientes, se favorezca su sumoilación para estabilizarla, en acorde con la acumulación de Ckk2 a lo largo del tiempo.[eng] CAMK´s are a family of Ca2+/CaM dependent kinases important for several cellular processes such as gene transcription, surveillance and cell death, cytoskeleton organization, learning and memory (Swulius & Waxham 2008). Functionality of this family of kinases has been demonstrated in fission yeast where expression of human CAMKII in Schizosaccharomyces pombe produced cell cycle arrest. Moreover, a mammalian CAMKI homolog has been described in S. pombe, Cmk1. Cmk1 is activated by binding to Ca2+/CaM complex and phosphorylation by an upstream kinase. Our group has observed that phosphorylation of Cmk1 in response to calcium stress is absent in deletion of the CaMKK, Ckk2. (Cisneros-Barroso et al. 2014). At the present work, we have defined that Ckk2 phosphorylates in vivo and in vitro Cmk1, like its mammalian counterpart CAMKK2; establishing a CAMK cascade in S. pombe. Besides, Ckk2 binds to Ca2+/CaM complex constituting a CaM kinase itself . Cell viability of mutants exposed to certain conditions, gives some clues about the function of the mutated gene. So we found that Δckk2 mutant was sensitive to cytoskeleton disrupting agents (thiabendazol, latrunculina) and resistant to a chemical that disrupt cell wall (calcofluor). On the other hand, we analyzed Δckk2 in starving conditions and found that ckk2 deletion doesn’t have impact on cell viability, but it’s important for cytokinesis. We observed a delayed in cytokinesis upon glucose starvation and a high septation index in nitrogen starvation. Furthermore, we find that Ckk2 expression is upregulated at both, upon nitrogen and glucose starvation, and a modification by sumo is also observed. The lysine 202 is a consensus sequence for sumoylation and is conserved between CAMKK homologs. However, in mammalian CAMKK2, the K202 is ubiquitinated (Kim et al. 2011). We have evaluated Ckk2 ubiquitination, using antibodies and Ckk2 is not ubiquitinated. It is reported that the same lysine could be a target for ubiquitine and sumo, where sumoylation protects proteins from degradation by ubiquitynation (Miteva et al. 2010). According to our results, its reasonable to think that in rich nutrient media Ckk2 is target for degradation, and when nutrient availability is limited Ckk2 is expressed and stabilized by sumo.Universitat de BarcelonaAligué i Alemany, Rosa MariaUniversitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències2015info:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionapplication/pdfhttps://hdl.handle.net/2445/102941http://hdl.handle.net/10803/396284Tesis Doctorals - Departament - Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociènciesreponame:Dipòsit Digital de la UBinstname:Universidad de BarcelonaEspañolcc-by, (c) Yance, 2015http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/info:eu-repo/semantics/openAccessoai:diposit.ub.edu:2445/1029412026-05-27T06:46:51Z |
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