High-density bacterial immobilization strategies for the development of microbial biosensors
Els biosensors microbians són dispositius analítics que utilitzen microorganismes com elements de reconeixement. Els microorganismes s’immobilitzen a la superfície del transductor de manera que la interacció microorganisme-analit genera una senyal (electroquímica, òptica, entre altres) que pot ser q...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2020 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/670963 |
| Acceso en línea: | http://hdl.handle.net/10803/670963 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Immobilització de microorganismes Inmovilización de microorganismos Microorganisms immobilization Biosensors microbians Biosensores microbianos Microbial biosensors Ciències de la Salut 579 |
| Sumario: | Els biosensors microbians són dispositius analítics que utilitzen microorganismes com elements de reconeixement. Els microorganismes s’immobilitzen a la superfície del transductor de manera que la interacció microorganisme-analit genera una senyal (electroquímica, òptica, entre altres) que pot ser quantificada. Els biosensors microbians es poden fer servir en diferents àmbits d’aplicació com al diagnòstic clínic, la indústria alimentària o la monitorització mediambiental amb l’avantatge de ser portables, simples, barats, i per tant bones alternatives als mètodes de laboratori. Desafortunadament, el desenvolupament de biosensors microbians es veu obstaculitzat per: (i) la baixa reproductibilitat que presenten els protocols d’immobilització de les cèl·lules, (ii) la seva poca sensibilitat, deguda a la dificultat d’immobilitzar elevades concentracions de microorganismes, i (iii) la curta vida útil dels mateixos, deguda a la mort cel·lular durant el procés d’immobilització o emmagatzematge. Aquesta tesi descriu el desenvolupament de dues estratègies d’immobilització que permeten el confinament reproduïble de microorganismes a la superfície d’un elèctrode, amb elevades densitats i de manera reproduïble, i al mateix temps proporciona un entorn fisiològic que permet una adequada difusió dels nutrients, garantint la funcionalitat i la viabilitat dels microorganismes atrapats. En la primera estratègia, les cèl·lules microbianes romanen atrapades en una matriu polimèrica d’alginat-grafit electrodepositada a la superfície de l‘elèctrode mitjançant condicions molt suaus i fisiològiques (temperatura ambient, medi aquós, pH neutre…) de polimerització. Els elèctrodes recoberts d’alginat conductor s’obtenen després de l’electrodeposició potenciostàtica de mostres d’alginat dopades amb grafit (fins al 4% de grafit). La presència de grafit redueix la passivació de l’elèctrode i millora la resposta electroquímica dels sensors recoberts d’alginat. L’atrapament de microorganismes és molt eficient (4.4x107 cèl·lules per elèctrode) i reproduïble (CV <0.5%), sense comprometre la integritat ni l’activitat microbiana. En la segona estratègia, els microorganismes romanen atrapats en la matriu de polietersulfona, un material soluble en solvents orgànics que precipita en contacte amb medis aquosos en un procés anomenat inversió de fase. Hem demostrat que els microorganismes poden incorporar-se durant la formació de la membrana mantenint certa viabilitat. Amb aquest mètode, s’obtenen de manera reproduïble membranes de 300 µm amb 2.6x106 cèl·lules en el seu interior, que mantenen nivells acceptables d’integritat i viabilitat cel·lular. Tots dos sistemes s’han utilitzat per immobilitzar E. coli a la superfície d’elèctrodes serigrafiats per desenvolupar biosensors, en els quals, els microorganismes actuen com a elements de reconeixement. La biodetecció s’ha realitzat electroquímicament mitjançant la respirometria de ferricianur, de manera que els microorganismes atrapats dins de la matriu poden reduir el ferricianur en presència de glucosa i convertir-lo en ferrocianur. S’ha avaluat el rendiment analític dels dos biosensors microbians amperomètrics portant a terme un assaig de toxicitat utilitzant 3,5-diclorofenol (DCP) com a compost tòxic model. En tots dos casos, els biosensors van proporcionar una resposta depenent de la concentració de DCP, amb una dosi efectiva (EC50) de 3.5 ppm (alginat) i 9.2 ppm (polietersulfona), d’acord amb els valors reportats. Aquestes metodologies d’atrapament són susceptibles de producció en massa perquè permeten una producció fàcil i repetitiva de biosensors microbians robusts amb una bona sensibilitat. |
|---|