Análisis del potencial de los blastómeros del embrión de ratón a 8 células para generar células madre embrionarias
Las células madre embrionarias de ratón suelen derivarse de embriones en estadio de blastocisto, pero alternativamente pueden obtenerse a partir de blastómeros aislados del embrión a 8 células (Bm-mESCs). Sin embargo, la eficiencia de derivación a partir de blastómeros (25-50%) es menor que a partir...
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| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2023 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/689656 |
| Acceso en línea: | http://hdl.handle.net/10803/689656 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Cèl·lules mare embrionàries Embryonic stem cells Blastòmers Blastómeros Blastomeres Destí cel·lular Destino celular Cell fate Ciències Experimentals 576 |
| Sumario: | Las células madre embrionarias de ratón suelen derivarse de embriones en estadio de blastocisto, pero alternativamente pueden obtenerse a partir de blastómeros aislados del embrión a 8 células (Bm-mESCs). Sin embargo, la eficiencia de derivación a partir de blastómeros (25-50%) es menor que a partir de blastocitos (85%), lo cual puede deberse a una limitación técnica o a una limitación biológica inherente presente en alguno/s de los blastómeros. Esto último hace referencia a una posible predisposición de algunos blastómeros hacia un destino celular no pluripotente que impida generar Bm-ESCs a partir de ellos. Por ello, el principal objetivo de esta tesis es determinar la capacidad de los blastómeros del embrión a 8 células para generar líneas Bm-ESCs y analizar si dichas líneas comparten propiedades semejantes. En un primer trabajo, se buscó optimizar las condiciones técnicas del proceso de derivación, con el objetivo de aumentar la probabilidad de obtener 8 líneas Bm-ESC de un mismo embrión. Para ello, se estudió el efecto de moduladores de las vías de señalización implicados en pluripotencia (cocteles 2i y R2i), suplementos como la hormona adrenocorticotropa (ACTH), el uso de embriones criopreservados o el precultivo de los embriones con 2i o R2i, sobre las tasas de derivación de Bm-ESCs así como sobre la integridad del cariotipo y la expresión de marcadores de pluripotencia de las líneas generadas. El uso de R2i junto con ACTH y embriones criopreservados generó las mayores tasas de derivación a partir de blastómeros aislados (39%) de entre todos los tratamientos aplicados. Además, el uso de R2i dio lugar a una mayor integridad cromosómica de las líneas mESC generadas frente a 2i. Finalmente, el cultivo de los embriones con R2i aumentó el número de células del epiblasto en los blastocistos, aunque esto no se tradujo en un incremento en las tasas de derivación cuando los blastómeros aislados de los embriones tratados se utilizaron para generar mESC. En un segundo estudio se analizó la capacidad de los blastómeros hermanos del embrión a 8 células para generar células del epiblasto y líneas Bm-ESCs. Se observó que la mitad o menos de los blastómeros hermanos presentaban un mayor potencial para generar líneas Bm-ESCs. Sin embargo, la obtención de más de 4 líneas a partir de varios de los embriones usados demostró que los blastómeros con menor potencial también podían generar líneas Bm-ESCs. Esto puede deberse al uso del cocktail R2i durante el proceso de derivación, que podría redirigir el destino celular no pluripotente de los blastómeros con menor potencial hacia un destino pluripotente. Por lo tanto, parece que las características biológicas de cada blastómero, así como su plasticidad tras el aislamiento y las condiciones de cultivo, tienen un efecto sobre las tasas de derivación obtenidas. Por último, se analizó el transcriptoma de las líneas Bm-ESCs generadas a partir de distintos blastómeros del mismo embrión. Se observó que, para cada embrión, la mitad de las líneas generadas presentaban una mayor expresión de genes relacionados con la pluripotencia y el desarrollo que la otra mitad, lo que sugiere que probablemente se originaron a partir de aquellos blastómeros con un mayor potencial de desarrollo. En conjunto, el desarrollo de esta tesis ha permitido, por un lado, mejorar y simplificar el proceso de derivación de Bm-ESCs y, por otro lado, determinar que los blastómeros del embrión a 8 células poseen diferente habilidad para generar líneas de Bm-ESCs, si bien esta puede modularse mediante unas condiciones de cultivo adecuadas. En definitiva, el presente trabajo proporciona un mayor conocimiento sobre el potencial de desarrollo de los blastómeros del embrión preimplantacional de ratón, así como del proceso de derivación de Bm-ESCs. |
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