Enginyeria metabòlica de cèl·lules d'Escherichia coli
Molts productes d'interès en l'àmbit dels processos biotecnològics es produeixen per fermentació bacteriana i especialment, pel que fa a proteïnes recombinants, a partir del cultiu de bacteris com Escherichia coli. En aquest treball s'ha realitzat una caracterització fisiològica i met...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2002 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | español |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:37900 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/37900 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Fermentació Escherichia coli Metabolisme cel·lular Excreció |
| Sumario: | Molts productes d'interès en l'àmbit dels processos biotecnològics es produeixen per fermentació bacteriana i especialment, pel que fa a proteïnes recombinants, a partir del cultiu de bacteris com Escherichia coli. En aquest treball s'ha realitzat una caracterització fisiològica i metabòlica d' Escherichia coli en cultiu en bioreactor per tal d'obtenir les claus que permetin una millora de l'eficiència del procés des de l'enfoc de l'Enginyeria Metabòlica. S'ha identificat un factor que impedeix millorar l'eficiència del procés: l'excreció de subproductes. L'acetat és el principal subproducte metabòlic en cultius aeròbics d' Escherichia coli en medis minerals glucosats i, quan s'acumula al brou de fermentació, esdevé tòxic per a les cèl·lules, inhibint el creixement cel·lular i reduint l'expressió de gens recombinants. L'anàlisi de la distribució dels fluxos metabòlics intracel·lulars estimats per mitjà d'un model matemàtic del metabolisme basat en el plantejament de les equacions de balanç de matèria i l'estequiometria cel·lular, ha revelat que existeix un desajust entre la capacitat de captació i degradació de la glucosa fins a piruvat, producte final de la glucòlisi, i la d'incorporació d'Acetil-CoA al cicle dels àcids tricarboxílics (CAT). Aquest desajust impedeix a la cèl·lula aprofitar tota la glucosa captada per a funcions de biosíntesi i l'excreció d'acetat representa una vàlvula de seguretat pels excedents que la cèl·lula no pot aprofitar en la generació de nova biomassa i CO2. En aquest estudi ha sigut possible identificar els enzims clau involucrats en les reaccions suposadament causants del desajust metabòlic a Escherichia coli, s'han aïllat els gens i regulat la seva expressió mitjançant plasmidis d'expressió adequats. Les reaccions escollides com a potencials llocs d'actuació són la reacció d'incorporació de glucosa a la cèl·lula a través del sistema de transport de la Fosfotransferasa depenent de fosfoenolpiruvat (PTS) i la reacció anapleròtica de reompliment del CAT catalitzada per l'enzim Fosfoenolpiruvat-carboxilasa (PEPC). En ambdós casos es pretén balancejar el creixement en cultiu discontinu, reduint la formació de subproductes. La redistribució dels fluxos metabòlics per reducció del nombre de components EIICBGlc del sistema PTS mitjançant estratègies de silenciament de gens per RNA-Antisentit pel gen ptsG, així com la sobreexpressió del gen ppc que codifica per la PEPC ha permès reduir la formació d'acetat a Escherichia coli. La modificació dels nivells del component EIICBGlc del PTS ha permès redistribuir els fluxos sense afectar la velocitat específica de creixement. No obstant, la modificació dels fluxos per augment de la velocitat de reacció de la PEPC, ha afectat la velocitat específica de creixement i la velocitat específica de transport de glucosa. En resum es pot concloure que algunes de les modificacions genètiques realitzades han resultat satisfactòries en termes de l'objectiu desitjat -reduir la secreció d'acetat- i que els efectes de la modificació sobre la distribució dels fluxos metabòlics intracel·lulars es pot explicar a partir dels valors estimats pel model matemàtic. |
|---|