Patogenia de las diferentes formas lesionales de la paratuberculosis bovina y sus variaciones asociadas a la vacunación

176 p.

Detalhes bibliográficos
Autor: Zapico Sánchez, David
Tipo de documento: tese
Data de publicação:2025
País:España
Recursos:Universidad de León
Repositório:BULERIA. Repositorio Institucional de la Universidad de León
OAI Identifier:oai:buleria.unileon.es:10612/26060
Acesso em linha:https://hdl.handle.net/10612/26060
Access Level:Acceso aberto
Palavra-chave:Sanidad animal
Vacunas (Veterinaria)
Mycobacterium tuberculosis
Tuberculosis en animales
3109 Ciencias Veterinarias
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spelling Patogenia de las diferentes formas lesionales de la paratuberculosis bovina y sus variaciones asociadas a la vacunaciónPathogenesis of the different pathological forms of the bovine paratuberculosis and their variations associated with vaccinationZapico Sánchez, DavidSanidad animalVacunas (Veterinaria)Mycobacterium tuberculosisTuberculosis en animales3109 Ciencias Veterinarias176 p.[ES] La paratuberculosis es una enfermedad intestinal crónica que afecta a los rumiantes, tanto domésticos como silvestres, causada por Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis (Map). La infección tiene lugar a edades tempranas y puede evolucionar de diferentes formas, incluyendo la eliminación completa del agente por las defensas del hospedador, el establecimiento de una infección subclínica persistente o el desarrollo de signos clínicos en la edad adulta. Los animales infectados presentan además diferentes tipos de lesiones granulomatosas en el intestino en función de la fase de la enfermedad en la que se encuentren. Sin embargo, los factores que determinan el curso de la paratuberculosis y el desarrollo de las diferentes lesiones se desconocen. Por otra parte, la vacunación constituye el método de control más eficaz y económicamente rentable, reduciendo la incidencia de la enfermedad clínica, la gravedad de las lesiones intestinales y la eliminación de micobacterias con las heces. No obstante, las vacunas actuales presentan una serie de inconvenientes, ya que no impiden la infección, inducen la formación de granulomas en el punto de inoculación e interfieren con los sistemas de diagnóstico oficiales de la tuberculosis bovina. El objetivo general de la presente Tesis Doctoral es contribuir al conocimiento sobre la patogenia de la paratuberculosis bovina y de los mecanismos implicados en la protección conferida por las vacunas, mediante la evaluación de diferentes marcadores relacionados con la respuesta inmunitaria local. El primer objetivo específico fue evaluar la presencia de linfocitos T regulares (Treg), cuya función principal es la de modular la respuesta inmunitaria, en relación con los principales tipos de lesión asociados a la paratuberculosis bovina. Para ello, se llevaron a cabo técnicas inmunohistoquímicas empleando un anticuerpo frente al factor de transcripción FoxP3 en cortes histológicos de yeyuno, íleon y nódulos linfáticos mesentéricos de 30 bovinos infectados de forma natural con Map. Las secciones analizadas mostraban lesiones focales, con un número reducido de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) y localizadas exclusivamente en el tejido linfoide intestinal. Asimismo, se observaron lesiones difusas, que presentaban una carga variable de micobacterias, desde formas multibacilares (abundantes bacilos) hasta paucibacilares (escasos bacilos). Las células inmunomarcadas poseían una morfología compatible con linfocitos y presentaban una distribución heterogénea en el tejido, sin guardar relación con los granulomas. El mayor número de linfocitos Foxp3+ se observó en áreas con lesiones focales en comparación con las formas difusas, tanto paucibacilares como multibacilares, que no mostraron diferencias entre sí. Según estos resultados, la presencia de un mayor número de linfocitos Treg FoxP3+ a nivel intestinal se relaciona con una menor gravedad de las lesiones granulomatosas, pero no con la carga bacteriana. Las células Treg podrían jugar un papel en la contención de la infección, favoreciendo su latencia, y evitando una respuesta inflamatoria exacerbada. El segundo objetivo específico, dentro del cual se engloban el segundo y tercer estudio de esta Tesis Doctoral, consistió en valorar la asociación entre la respuesta inmunitaria innata local y los distintos tipos de lesión (focales, difusas paucibacilares y difusas multibacilares), evaluando la expresión de varios receptores tipo Toll (TLRs) y tipo NOD (NLRs). En concreto, se emplearon técnicas inmunohistoquímicas con anticuerpos frente a TLR1, TLR2, TLR4, TLR9, NOD1 y NOD2 en muestras de yeyuno, íleon y nódulos linfáticos regionales procedentes de 20 bovinos infectados de forma natural y experimental con Map. En las lesiones focales y difusas paucibacilares, se identificó únicamente la expresión de TLR9, lo que podría estar relacionado con la presencia de una respuesta inmunitaria celular y la formación de esferoplastos intracelulares. En cambio, las lesiones difusas multibacilares mostraron niveles altos de TLR1, TLR4, TLR9, NOD1 y NOD2, indicando la presencia de abundantes micobacterias tanto intracelulares como extracelulares y, potencialmente, contribuyendo a una respuesta antinflamatoria. La intensidad de la tinción frente a TLR9 fue mayor en las lesiones difusas multibacilares que en las formas focales y difusas paucibacilares, debido posiblemente al mayor número de micobacterias o a una sobrexpresión compensatoria. En conclusión, las poblaciones de macrófagos que forman los distintos tipos de lesión muestran diferentes patrones de expresión de TLRs y NLRs, los cuales se correlacionan con la carga bacteriana pero no con la extensión de las lesiones. La señalización de los TLRs y NLRs en los macrófagos podría modular la respuesta inmunitaria local y, por tanto, influir en el desarrollo de las diferentes formas patológicas. La segunda parte de esta Tesis Doctoral se centró en valorar la influencia de la vacunación frente a la paratuberculosis en la respuesta inmunitaria local y su relación con las lesiones intestinales. Para ello, se analizó la expresión local de TLR1, TLR2, TLR4, TLR9, IFN-γ, iNOS y CD204 en muestras de yeyuno, íleon, válvula ileocecal, nódulos linfáticos mesentéricos y preescapulares, así como en granulomas post-vacunales. Las muestras procedían de terneros utilizados en un estudio anterior para otros fines, vacunados con la vacuna comercial Silirum® a los tres meses de edad y de terneros no vacunados, todos ellos infectados experimentalmente con Map a los 60 días después de la vacunación. El número de macrófagos inmunomarcados y la intensidad de la inmunotinción para TLR9, iNOS y CD204 se valoró de forma semicuantitativa en los granulomas empleando un índice H, mientras que la valoración de TLR1, TLR2, TLR4 e IFN-γ se llevó a cabo de acuerdo con la cantidad de células positivas. Los terneros vacunados que presentaban lesiones focales mostraron un mayor número de macrófagos inmunomarcados frente a TLR2 a nivel intestinal. En las lesiones focales de los terneros vacunados, los macrófagos mostraron una alta expresión de iNOS, indicando una polarización M1, mientras que, en los animales no vacunados o vacunados con formas multifocales, presentaron un fenotipo M2, con una expresión elevada de CD204. El número de células positivas a IFN-γ, morfológicamente compatibles con linfocitos, se correlacionó de forma directa con la gravedad de las lesiones intestinales, pero no con el estado de vacunación. Con respecto al granuloma vacunal, los terneros vacunados con lesiones focales mostraron mayores niveles de TLR2 e IFN-γ que aquellos con formas multifocales, indicando una mayor respuesta a la vacunación. Todos estos resultados sugieren que la vacunación con Silirum® induce un aumento de la respuesta inmunitaria a nivel local.[EN] Paratuberculosis is a chronic wasting disease of the domestic and wild ruminants, caused by Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis. The infection occurs at a young age and may show different outcomes, including the complete clearance of the pathogen by the host defenses, the onset of a persistent subclinical infection and the development of clinical signs in the adulthood. Infected animals also show different types of granulomatous lesions at the intestine depending on the stage of the disease. Nevertheless, the factors that determine the course of paratuberculosis and the development of the different lesions remain unknown. On the other hand, vaccination is the most cost-effective control method by reducing the incidence of clinical disease, the severity of the intestinal lesions and the elimination of mycobacteria through the feces. Nonetheless, modern vaccines present several disadvantages, since they do not prevent the infection, induce the formation of granulomas in the site of the injection and interfere with the official diagnostic methods of bovine tuberculosis. The general aim of the present PhD Thesis is to contribute to the knowledge about the pathogenesis of bovine paratuberculosis and the mechanisms implicated in the protection conferred by vaccines, through the evaluation of different local immune markers. The first specific objective was to evaluate the presence of T regulatory (Treg) lymphocytes, which display immunomodulatory functions, in relation to the main types of lesions associated with bovine paratuberculosis. For this purpose, immunohistochemical techniques were employed using an antibody against the transcription factor FoxP3 in histologic sections from the jejunum, ileum and mesenteric lymph nodes of 30 bovines naturally infected with Map. The sections analyzed contained focal lesions, characterized by low amounts of acid-fast bacilli (AFB) and restricted to the intestinal lymphoid tissue, as well as diffuse lesions with abundant (multibacillary) or scarce (paucibacillary) mycobacteria. The immunolabeled cells were morphologically consistent with lymphocytes and showed a heterogeneous distribution among the tissue, unrelated to the granulomas. The highest number of FoxP3+ lymphocytes was observed in areas with focal lesions compared to the diffuse forms, both paucibacillary and multibacillary, which showed no difference. According to these results, the presence of increased numbers of FoxP3+ Treg lymphocytes in the intestine is associated with less severe granulomatous lesions, but not with the bacterial burden. Treg cells may play a role in the containment of the infection, favoring its latency and preventing an exacerbated inflammatory response. The second specific objective, which encompasses the second and third study of this Thesis, was to evaluate the association between the local innate immune response and the different type of lesions (focal, diffuse paucibacillary and diffuse multibacillary), by assessing the expression of different Toll-like (TLR) and NOD-like (NLR) receptors. In depth, immunohistochemical techniques with antibodies against TLR1, TLR2, TLR4, TLR9, NOD1 and NOD2 were used in samples from the jejunum, ileum and regional lymph nodes of 20 bovines naturally and experimentally infected with Map. Focal and diffuse paucibacillary lesions exclusively showed TLR9 expression, which could be associated to the presence of a cellular immune response and the formation of intracellular spheroplasts. By contrast, diffuse multibacillary lesions showed high levels of TLR1, TLR4, TLR9, NOD1 and NOD2, indicating the presence of abundant intracellular and extracellular mycobacteria and, potentially, leading to an anti-inflammatory response. The intensity of TLR9 staining was greater in the diffuse multibacillary lesions than in the focal and diffuse paucibacillary forms, possibly due to the higher number of mycobacteria or a compensatory overexpression. In conclusion, the macrophage populations that form the different types of lesion display distinct patterns of TLR and NLR expression, which correlate with the bacterial load but not with the extension of the lesions. TLR and NLR signaling in macrophages may modulate the local immune response and, thus, influence the development of the different pathological forms. The second part of this PhD Thesis focused on the evaluation of the influence of paratuberculosis vaccination in the local immune response and its relationship with the intestinal lesions. To achieve this, the expression of TLR1, TLR2, TLR4, TLR9, IFN-γ, iNOS and CD204 was assessed in samples from the jejunum, ileum, mesenteric and prescapular lymph nodes, as well as the post-vaccination granulomas. The samples came from calves used in a previous study for other purposes, vaccinated with the commercial vaccine Silirum® at 3 months and from unvaccinated calves, all of them experimentally infected with Map at 60 days post-vaccination. The number of immunolabeled macrophages and the intensity of the staining for TLR9, iNOS and CD204 was semiquantitatively assessed in the granulomas using an H-score, while TLR1, TLR2, TLR4 and IFN-γ evaluation was made according to the number of positive cells. Vaccinated calves with focal lesions showed higher numbers of macrophages immunolabeled for TLR2 at the intestine. In the focal lesions of vaccinated calves, macrophages showed a high expression of iNOS, indicating a M1 polarization, while unvaccinated animals or those vaccinated with multifocal forms showed a M2 phenotype, with intense CD204 expression. The number of positive cells for IFN-γ, morphologically compatible with lymphocytes, was directly correlated with the severity of the intestinal lesions but not with the immunization status. Regarding the vaccine granuloma, vaccinated calves with focal lesions had higher levels of TLR2 e IFN-γ than those with multifocal forms, indicating a greater response to vaccination. Taken together, these results suggest that vaccination with Silirum® boosts the local immune response.Espinosa Cerrato, JoséFernández Fernández, MiguelSanidad AnimalFacultad de Veterinaria2025info:eu-repo/semantics/doctoralThesishttps://hdl.handle.net/10612/26060reponame:BULERIA. Repositorio Institucional de la Universidad de Leóninstname:Universidad de LeónEspañolhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/info:eu-repo/semantics/openAccessoai:buleria.unileon.es:10612/260602026-06-24T12:43:27Z
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